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目前,全球范围内肝脏疾病患者超过13亿,是世界疾病负担和死亡的重要原因之一。10%-15%的慢性肝病患者在5-10年后会发生肝纤维化,并进一步发展为肝硬化甚至肝癌。肝纤维化是肝内细胞外基质(ECM)稳态失衡而在肝内异常沉积,导致肝脏结构和功能发生异常改变的一种可逆性病理变化。若其进一步发展成肝硬化等疾病则难以逆转。因此,阐明肝纤维化发生机制,逆转或阻断肝纤维化进程,寻找肝纤维化的易感因素有利于肝纤维化的预防和进一步的靶向治疗。众所周知,酒精是肝纤维化的易感因素。乙醇首先经乙醇代谢酶(ADH)氧化形成乙醛,随后被乙醛代谢酶(ALDH)氧化生成乙酸。乙醛具有致突变和致癌性,在酒精性疾病发展为肝纤维化甚至是肝癌中起着重要的作用。另外,ADH除了代谢乙醇,主要还参与视黄醇的代谢。人体内约80%的视黄醇(即维生素A)储存于静息状态下的肝星状细胞(HSC)。视黄醇经ADH氧化形成视黄醛,随后经视黄醛脱氢酶(RALDH)氧化生成视黄酸(RA)。近年来,越来越多的证据显示视黄醇的代谢物视黄酸(RA)参与肝纤维化的进程。人体内ADH同工酶根据动力学特征及氨基酸序列等可分为七种酶。乙醇主要经肝脏中ADHⅠ代谢,而视黄醇主要经肝脏中ADHⅠ、ADHⅠⅠⅠ代谢,其中ADHⅠ的表达及对视黄醇的代谢活性显著高于ADHⅠⅠⅠ。而我们课题组前期结果表明人肝纤维化组织中ADHⅠ的活性显著高于正常组织约3倍之多。另外发现ADH活性的高低与二乙基亚硝胺DEN所诱导肝纤维化的程度之间呈明显正相关性。提示,ADHⅠ可能参与乙醇与非乙醇激活HSC而导致的肝纤维化,但其相关机制尚未阐明。细胞外基质ECM的合成与降解的稳态失衡是肝纤维化时肝组织发生的主要病理改变。异常激活的HSC是ECM的主要来源,是肝纤维化发生的关键。在肝纤维化过程中,实质损伤导致的炎症反应产生大量信号,HSCs被激活并随之分化为肌成纤维细胞(Myofibroblast,MFB),从而分泌大量胶原纤维,形成肝纤维化。但ADHⅠ在HSC活化中的作用尚未见报道。为了进一步确认ADHⅠ活性与肝纤维化的关系,我们首先建立ADHⅠ高表达及沉默的大鼠肝星状细胞系(HSC-T6)模型。并分别用乙醇和非乙醇:LPS、TGF-β1进行激活。通过Real-time PCR和Western-blot检测ADHⅠ的表达、纤维化指标Ⅰ型胶原蛋白(COL1A1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)等mRNA水平,分析外源性激活HSC-T6过程中ADHⅠ的表达,以及ADHⅠ表达变化对有、无外源刺激HSC活化相关因子表达的影响,并探讨其相关机制。该研究拟提供抗肝纤维化的靶点,具有重要的基础和临床意义。方法1 ADHⅠ真核表达载体构建1.1 PCR特异性扩增ADHⅠ基因以大鼠肝脏c DNA文库为模板,设计5’端带有Hind ⅠⅠⅠ(5’A|AGCTT3’)和Eco RⅠ(5’G|AATTC3’)的特异性引物,PCR扩增ADHⅠ基因。1.2 p EGFP-ADHⅠ真核表达载体的构建与鉴定通过Hind ⅠⅠⅠ和Eco R Ⅰ酶将扩增后的基因片段和p EGFP-N1质粒分别进行双酶切,T4 DNA连接酶连接后转化E.coli DH5α感受态细胞,卡那霉素抗性筛选阳性克隆,扩增,提取质粒进行酶切和测序鉴定。2构建ADHⅠ高表达及低表达HSC-T6细胞株采用脂质体瞬时转染法将构建的PEGFP-ADHⅠ重组质粒或合成的si ADHⅠ片段转染入HSC-T6中,于24h、48h后镜下观察转染效率。并进一步通过Real-time PCR和Western-blot测定ADHⅠ的表达水平。3 ADHⅠ的表达水平对HSC-T6细胞株活化的影响提取对照组、ADHⅠ高表达组和ADHⅠ低表达组的RNA,测定COL1A1的mRNA表达水平。4外源性刺激对ADHⅠ表达的影响乙醇、TGF-β1、LPS刺激p EGFP-N1对照组24h、48h后,提取细胞中的RNA和蛋白,测定ADHⅠ的表达水平。5 ADHⅠ的表达水平对外源性刺激HSC-T6细胞株活化的影响乙醇、TGF-β1、LPS分别刺激p EGFP-N1对照组、ADHⅠ高表达组和ADHⅠ低表达组24h、48h后,测定COL1A1和α-SMA的mRNA表达水平。结果1 ADHⅠ真核表达载体构建1.1 PCR特异性扩增ADHⅠ基因以大鼠肝脏中提取的RNA,反转录成c DNA为模板,扩增出的ADHⅠ基因片段的长度约为1148bp,与编码ADHⅠ的序列长度一致。1.2 p EGFP-ADHⅠ真核表达载体的构建与鉴定卡那霉素抗性下筛选阳性克隆,提取质粒,经Hind ⅠⅠⅠ和Eco R Ⅰ双酶切,均得到约4700bp和1148bp的片段,测序证实读码框正确无误。2构建ADHⅠ高表达及低表达HSC-T6细胞株通过倒置荧光显微镜观察ADHⅠ高表达组发出绿色荧光,并且ADHⅠ的mRNA和蛋白表达水平进一步表明成功构建ADHⅠ高表达及低表达HSC-T6细胞株。3 ADHⅠ的表达水平对HSC-T6细胞株活化的影响ADHⅠ高表达后,COL1A1 mRNA水平明显升高(P<0.05);ADHⅠ低表达后,COL1A1 mRNA水平明显降低(P<0.0001)。4外源性刺激对ADHⅠ表达的影响乙醇刺激对照组24h、48h后,ADHⅠ mRNA和蛋白表达水平均明显升高(P<0.01);TGF-β1刺激对照组24h、48h后,ADHⅠ mRNA表达水平无明显变化,ADHⅠ蛋白水平在48h明显升高(P<0.05);LPS刺激对照组24h后,ADHⅠ表达水平无明显变化,48h后ADHⅠ表达水平明显升高(P<0.05)。5 ADHⅠ的表达水平对外源性刺激HSC-T6细胞株活化的影响5.1 ADHⅠ的表达水平对外源性刺激HSC-T6细胞株活化的影响乙醇刺激ADHⅠ高表达组24h、48h后,与对照组相比,COL1A1 mRNA水平明显升高(P<0.01),α-SMA mRNA水平在24h明显升高(P<0.001),48h无明显变化;乙醇刺激ADHⅠ低表达组24h、48h后,与对照组相比,COL1A1mRNA水平明显降低(P<0.001),α-SMA mRNA水平在24h明显降低(P<0.01),48h无明显变化。TGF-β1刺激ADHⅠ高表达组24h、48h后,与对照组相比,COL1A1mRNA水平明显升高(P<0.05),α-SMA mRNA水平在24h明显升高(P<0.001),48h无明显变化;TGF-β1刺激ADHⅠ低表达组24h、48h后,与对照组相比,COL1A1 mRNA水平明显降低(P<0.05),α-SMA mRNA水平在24h明显降低(P<0.01),48h无明显变化。LPS刺激ADHⅠ高表达组24h、48h后,与对照组相比,COL1A1 mRNA水平明显升高(P<0.01),α-SMA mRNA水平在24h明显升高(P<0.05),48h无明显变化;LPS刺激ADHⅠ低表达组24h、48h后,与对照组相比,COL1A1mRNA水平明显降低(P<0.001),α-SMA mRNA水平在24h明显降低(P<0.001),48h无明显变化。5.2不同外源性刺激HSC-T6细胞株活化的影响与非乙醇刺激ADHⅠ高表达组相比,乙醇刺激24h、48h后,COL1A1mRNA水平明显升高(P<0.05)。结论1.乙醇与非乙醇均促进HSC-T6中ADHⅠ的表达,并且乙醇刺激ADHⅠ升高的程度显著高于非乙醇因素。2.ADHⅠ升高是肝纤维化的易感因素。其机制可能与ADHⅠ促进HSC活化有关。