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背景:艾燃烧生成物(Moxa Combustion Products,MCP)的效用是艾灸的作用机理之一,MCP是指在艾绒燃烧过程生成的产物,艾烟是其最主要的部分。MCP中含有一定量的颗粒物(Particulate Matter,PM),研究显示艾灸诊室PM10平均质量浓度为3.54mg/m3,超过医院候诊室卫生标准(GB9671-1996)中规定的最高限值(0.15 mg/m3);尤其是MCP的颗粒物中存在一定比例PM2.5,引发关注和担忧;而目前MCP中的颗粒物是否是艾灸疗效的关键因素未有研究。近年来,医疗市场也出现了以艾叶精油穴位涂抹、艾绒穴位热熨、艾烟滤过等艾烟的处理和替代方法甚至医疗设备。针对此,我们根据艾绒燃烧过程的不同阶段,提取各阶段的MCP产物,探索艾灸的关键起效环节,并研究艾烟中的颗粒物是否是艾灸疗效的关键因素。动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是心脑血管疾病的主要病理基础。内皮功能障碍(Endothelial Cell Dysfunction,ECD)是AS发病的始动环节,也是影响AS疾病进展的关键因素。一氧化氮(Nitric Oxide,NO)是ECD过程中最重要的血管活性物质,NO的合成受活化的内皮型一氧化氮合酶(Endothelial Nitric Oxide Synthase,eNOS)调控。研究显示,艾灸和艾烟可调节NO/ET-1平衡、PGI2/TXA2平衡,纠正血液流变的异常,改善内皮细胞功能,以减轻AS病变程度。因此,开展以eNOS活化调控AS的研究对于探寻中医艾灸治疗机理很有必要。课题组前期开展了艾灸和艾烟干预载脂蛋白E基因敲除(ApolipoproteinEknockout,ApoE-/-)小鼠的研究,显示出可通过良性调节脂质代谢、减轻炎症反应及内皮损伤等效应防治AS。目的:观察不同处理方式MCP(艾烟、滤过艾烟、艾绒挥发物及艾叶精油)对AS的作用,从eNOS活化相关信号通路观察其对血管内皮功能的影响,探索艾灸干预AS的起效环节及作用机制,并探讨MCP中的颗粒物是否艾灸起效的关键成分。方法:将60只雄性8周龄ApoE-/-小鼠随机均分为5组:艾烟组、滤过艾烟组、艾绒挥发组、艾叶精油组、模型组,12只同龄雄性C57BL/6小鼠作为正常对照。正常组、模型组小鼠常规抓取、固定;艾烟组小鼠暴露于2%浓度(以染毒柜遮光率度量)艾烟环境,每次约燃烧1.5 g艾绒;滤过艾烟组小鼠暴露于1.5 g艾绒点燃滤过后的艾烟环境;艾绒挥发组小鼠暴露于1.5g艾绒在150℃加热条件下的挥发物环境;艾叶精油组小鼠置暴露在3.75μL艾叶精油(1.5 g艾绒所含挥发油含量折合)加入16 mL蒸馏水雾化形成的环境中。所有干预均在染毒柜中进行,20 min/日,6日/周,连续干预14周。生化法检测血浆TC、TG、HDL-C、LDL-C、NO的含量;Elisa法测定血浆ox-LDL、ApoA-I、ET-1、PGI2、TXA2、VEGF、vWF的含量;HE染色、油红“O”染色观察主动脉根、胸主动脉病理改变;Western blot法检测主动脉组织中AMPK、PI3K、AKT和eNOS 蛋白的表达及磷酸化蛋白 p-AMPK、p-PI3K、p-AKT、p-eNOS-Thr495、p-eNOS-Ser1177蛋白表达情况;RT-PCR法检测主动脉Ampk-mRNA、Pi3k-mRNA、Akt-mRNA和eNos-mRNA表达情况。结果:1.脂质代谢水平模型组小鼠血浆TC、TG、HDL-C、LDL-C、ox-LDL含量均显著高于正常组(P<0.01或P<0.05),血浆APOA-I含量与正常组无显著差异(P>0.05)。艾烟组小鼠血浆TC、TG、LDL-C、ox-LDL含量显著低于模型组(P<0.01或P<0.05),HDL-C含量显著高于模型组(P<0.01),ApoA-I含量与模型组无显著差异(P>0.05)。滤过艾烟组小鼠血浆TC、TG、LDL-C含量显著低于模型组(P<0.01或P<0.05),HDL-C含量显著高于模型组(P<0.01),ApoA-I、ox-LDL含量与模型组无显著差异(P>0.05)。艾绒挥发组小鼠血浆TC含量显著低于模型组(P<0.01),TG、HDL-C、LDL-C、ApoA-I、ox-LDL含量与模型组无显著差异(P>0.05)。艾叶精油组小鼠血浆TC、TG、HDL-C、LDL-C、ox-LDL、ApoA-I含量与模型组无显著差异(P>0.05)。MCP各组组间比较,艾烟组、滤过艾烟组、艾绒挥发组、艾叶精油组对降低血浆TC水平效果依次下降,组间比较均有统计学差异。除TC外,艾烟组与滤过艾烟组对于调节其他各项血脂水平方面无显著性差异;艾烟组、滤过艾烟组对于降低血浆TG、HDL-C水平显著优于艾叶精油组;艾烟组对于降低血浆LDL-C水平显著优于艾绒挥发组、艾叶精油组;艾烟组对于降低血浆ox-LDL水平显著优于艾叶精油组。2.主动脉病理正常组小鼠未见明显异常;模型组小鼠可见明显的AS病理改变(AS斑块形成);艾烟组、滤过艾烟组、艾绒挥发组较模型组明显改善(AS斑块程度减轻),艾叶精油组较模型组未见明显改善(AS斑块形成)。3.血管内皮功能模型组小鼠血浆NO、NO/ET-1、PGI2水平显著低于正常组(P<0.01或P<0.05),血浆ET-1、TXA2、TXA2/PGI2(T/P)水平显著高于正常组(P<0.01或P<0.05),血浆VEGF、vWF与正常组无显著差异(P>0.05)。艾烟组小鼠血浆NO、PGI2、NO/ET-1水平显著高于模型组(P<0.01),血浆ET-1含量、T/P显著低于模型组(P<0.01),TXA2、VEGF、vWF含量与模型组无显著差异(P>0.05)。滤过艾烟组小鼠血浆NO、NO/ET-1水平显著高于模型组(P<0.05),ET-1含量、T/P显著低于模型组(P<0.01),TXA2、PGI2、VEGF、vWF含量与模型组无显著差异(P>0.05)。艾绒挥发组小鼠血浆NO、NO/ET-1水平显著高于模型组(P<0.05),小鼠血浆ET-1含量、T/P显著低于模型组(P<0.01,P<0.05),TXA2、PGI2、VEGF、vWF含量与模型组无显著差异(P>0.05)。艾叶精油组小鼠血浆PGI2含量显著高于模型组(P<0.05),血浆T/P 比值显著低于模型组(P<0.01),血浆NO、ET-1、NO/ET-1、TXA2、VEGF、vWF与模型组无显著差异(P>0.05)。MCP各组组间比较,艾烟组升高NO显著优于艾叶精油组,滤过艾烟组、艾绒挥发组ET-1显著低于艾叶精油组,艾烟组、滤过艾烟组、艾绒挥发组升高NO/ET-1显著优于艾叶精油组,艾烟组升高PGI2显著优于滤过艾烟组、艾绒挥发组,艾烟组T/P 比值显著低于艾绒挥发组,TXA2、VEGF、vWF组间比较均无显著性差异。4.eNOS活化相关信号通路模型组的主动脉p-AKT蛋白、p-AKT/AKT 比值均显著高于正常组(P<0.01),主动脉p-eNOS-Ser1177 蛋白、p-eNOS-Ser1177/eNOS 比值、p-AMPK 蛋白、p-AMPK/AMPK比值、p-PI3K 蛋白、p-PI3K/PI3K 比值、Ampk-mRNA、PI3K-mRNA、eNos-mRNA均显著低于正常组(P<0.01或P<0.05)。艾烟组的主动脉p-eNOS-Thr1177 蛋白、p-eNOS-Thr1177/eNOS 比值、p-AMPK 蛋白、p-AMPK/AMPK比值、Ampk-mRNA、eNos-mRNA均显著高于模型组(P<0.01),主动脉p-eNOS-Thr495 蛋白、p-eNOS-Thr495/eNOS 比值、p-AKT 蛋白、p-AKT/AKT 比值均显著低于模型组(P<0.01)。滤过艾烟组的主动脉p-eNOS-Thr1177 蛋白、p-eNOS-Thr1177/eNOS 比值、p-AMPK蛋白、p-AMPK/AMPK比值、Ampk-mRNA、eNos-mRNA均显著高于模型组(P<0.01或P<0.05),主动脉 p-eNOS-Thr495 蛋白、p-eNOS-Thr495/eNOS 比值、p-AKT 蛋白、p-AKT/AKT比值均显著低于模型组(P<0.01)。艾绒挥发组的主动脉Ampk-mRNA、eNos-mRNA均显著高于模型组(P<0.05),主动脉主动脉 p-eNOS-Thr495 蛋白、p-eNOS-Thr495/eNOS 比值、p-eNOS-Thr1177 蛋白、p-eNOS-Thr1177/eNOS 比值、p-AKT蛋白、p-AKT/AKT 比值均显著低于模型组(P<0.01 或P<0.05)。艾叶精油组的主动脉 p-eNOS-Thr495 蛋白、p-eNOS-Thr495/eNOS 比值、p-eNOS-Thr1177蛋白、p-AKT蛋白、p-AKT/AKT比值均显著低于模型组(P<0.01或P<0.05)。结论:1.艾烟、滤过艾烟可以良性调节脂质代谢、改善内皮细胞功能,从而减缓AS的进展,且二者疗效相当;即艾烟中的颗粒物在此过程中无显著作用,可能并不是艾灸起效的关键成分。2.与艾烟比较,一定浓度的艾绒挥发物、艾叶精油对于调节脂质代谢、减轻主动脉病变、改善内皮功能疗效欠佳;即艾绒的燃烧可能是艾灸起效的关键环节。3.艾烟、滤过艾烟通过激活AMPK蛋白的磷酸化,促进eNOS蛋白的Ser1177位点磷酸化及Thr495位点去磷酸化,提升NO水平以调节血管活性,可能是艾烟及滤过艾烟改善内皮功能的机制之一。