【摘 要】
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目的:糖苷类成分广泛分布于中药药用植物体内,且多为中药有效活性物质,如葛根素、荭草素、牡荆素等。糖苷类化合物根据糖苷键的不同通常可分为O-苷,S-苷,N-苷和C-苷,其苷元在预防和治疗疾病中的有着重要作用,研究者们对苷类化合物糖苷键的断裂机制进行了深入研究。从整体看来,关于O-苷,S-苷,N-苷的苷键裂解机制研究相对清楚,但C-苷键裂解的机制研究较为滞后,因为C-苷有着稳定的C-C单键结构且极难溶
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目的:糖苷类成分广泛分布于中药药用植物体内,且多为中药有效活性物质,如葛根素、荭草素、牡荆素等。糖苷类化合物根据糖苷键的不同通常可分为O-苷,S-苷,N-苷和C-苷,其苷元在预防和治疗疾病中的有着重要作用,研究者们对苷类化合物糖苷键的断裂机制进行了深入研究。从整体看来,关于O-苷,S-苷,N-苷的苷键裂解机制研究相对清楚,但C-苷键裂解的机制研究较为滞后,因为C-苷有着稳定的C-C单键结构且极难溶解,此外C-苷类化合物还具有数量众多,结构复杂,性质各异的特点,因而一般的糖苷键裂解机制研究方法很难对C-苷键奏效,相关研究存在较大困难。而酶解法具有高度特异性,催化效率高和反应条件温和的特点,对于研究C-苷键裂解机制具有巨大优势。肠道菌群中存在较为丰富的断裂C-苷键菌株及相关酶系,故本课题以肠道菌株PUE中鉴定出的C-苷裂解酶系DgpA、DgpB-C突变体复合物为研究对象展开研究,通过结构生物学和化学生物学手段对DgpA和DgpB-C突变体复合物的结构和功能进行了深入探究,以期解析C-苷裂解酶催化C-苷键断裂的分子机制,有助于利用或改造其作为药物成分。方法:本课题使用了蛋白质层析纯化、蛋白晶体生长和优化及X-射线晶体衍射法等结构生物学实验方法对DgpA和DgpB-C复合物蛋白结构进行了探究,此外还通过高效液相色谱、质谱和酶学等化学生物学相关实验方法对其功能进行了验证。结果:第一章工作,主要设计构建了 DgpA野生型和各类型突变体表达载体,并采用大肠杆菌系统进行蛋白表达,获取了 DgpA野生型及突变体蛋白。利用纯化的蛋白筛选和生长晶体,完成了 DgpA的晶体结构解析,并将纯化蛋白用于后续功能实验。第二章工作,主要设计构建了 DgpB和DgpC突变体表达载体,采用大肠杆菌系统表达并获取了突变体蛋白,并对生长出的DgpB-C复合物突变体晶体进行了结构生物学方面的研究。第三章工作,利用前期工作所获取的DgpA和DgpB-C复合物蛋白进行了功能方面的研究,包括排除了 DgpA和DgpB-C复合物之间的相互作用,测试了 DgpA和DgpB-C复合物的转化活性谱,探索了关键残基对于C-苷键裂解功能的影响,测定了相关的酶动力学参数,确认了 DgpA广泛的底物结合能力等。结论:本文主要从结构和功能两方面,对于肠道菌群PUE中发挥C-苷键裂解功能的DgpA和DgpB-C复合物进行了研究。成功解析了分辨率为2.7 A的无底物状态DgpA野生型结构和2.4 （?）的葡萄糖结合状态下DgpA野生型结构,发现DgpA为同源六聚体氧化还原酶。同时确定了 DgpA发挥氧化功能的分子机制和结构证据,并确定了其关键氨基酸残基信息,填补了 C-苷键断裂起始步骤分子机制的空白,推测DgpA极有可能含有对于控制酶内部反应活性有重要作用的自抑制结构。此外还解析了分辨率为2.1 （?）的无底物结合的DgpB-C复合物143位组氨酸突变体的α4β4-异八聚体结构。在功能研究中根据一系列酶动力学参数和酶活数据的测定结果,发现突变体明显降低了 DgpA和DgpB-C复合物对于C-苷键的裂解活性。此外,还通过一系列氧化反应测试,验证了 DgpA的自抑制结构功能,确认了其广泛的底物结合能力及其针对于葡萄糖类似结构的底物特异性,并提出了 DgpA/B/C催化C-苷键断裂的分子机制。
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