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本课题拟采用荧光探针Fluo-3和Rhod-2标记新鲜分离的16周糖尿病大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞，激光共聚焦显微镜扫描技术实时、动态地监测胞浆钙和线粒体钙运动变化情况，研究糖尿病情况下线粒体钙调控的异常变化。
研究方法：
将180-230g的wistar雄性的大鼠随机分为糖尿病组和对照组，糖尿病组一次性腹腔内注射STZ诱导成糖尿病模型，对照组腹腔内注射等剂量的溶剂。16周后断颈处死大鼠，取出胸主动脉，二步酶消化法新鲜分离获取胸主动脉血管平滑肌细胞(VSMC)。采用新一代Ca<'2+>荧光探针Fluo-3和Rhod-2分别标记VSMC的胞浆钙([Ca<'2+>]i)和线粒体钙([Ca<'2+>]m)，结合激光共聚焦显微镜扫描技术实时、动态地监测[Ca<'2+>]i和[Ca<'2+>]m运动变化情况，进行以下实验：(1)比较糖尿病组和对照组KCl诱导的钙内流和phe/Ryanodine触发的Ca<'2+>释放与Ca<'2+>内流对线粒体Ca<'2+>浓度的影响；(2)采用线粒体解偶剂CCCP抑制线粒体钙摄取，比较糖尿病组和对照组CCCP对KCl诱导的Ca<'2+>内流和对TG触发的钙池操纵性钙内流的影响。
研究结果：
1．STZ诱导糖尿病模型成功，糖尿病大鼠出现多饮，多食，多尿，体重增长缓慢，血糖水平高等典型症状。
2．采用二步酶消化法可获得较多的VSMC，显微镜下可见细胞呈棒状、曲棍状、长条形或圆形，折光度强。采用台盼蓝拒染法检测细胞活性，测得活细胞的比率>95﹪。抗一平滑肌细胞肌动蛋白免疫组化染色显示平滑肌细胞内肌丝被染成褐色，证实所分离的细胞为VSMC。
3．有钙液中，60mmol·L<'-1>KCl去极化细胞膜引起胞浆Ca<'2+>浓度升高，16周的糖尿病组明显高于对照组；KCl诱导的Ca<'2+>内流可引起线粒体Ca<'2+>浓度升高，糖尿病组也明显高于对照组，两组达峰时间无显著性差异。
4．10 μ M phe可触发Ca<'2+>释放和胞外Ca<'2+>内流，16周的糖尿病组与对照组相比，phe触发的Ca<'2+>释放和Ca<'2+>内流都显著降低，且达峰时间(TTP)明显延长(P<0.05)；phe触发的Ca<'2+>释放和Ca<'2+>内流均可引起线粒体Ca<'2+>摄取，导致[Ca<'2+>]m升高。16周的糖尿病病组与对照组相比，phe触发的Ca<'2+>释放和Ca<'2+>内流引起的[Ca<'2+>]m升高程度明显低于对照组，且达峰时间明显长于对照组。提示：糖尿病情况下，IP3途径触发的Ca<'2+>释放和Ca<'2+>内流明显降低，且phe触发的Ca<'2+>释放和内流能引起线粒体Ca<'2+>摄取，糖尿病线粒体钙摄取幅度和速度显著降低。
5．1 μ M Ryanodine可触发Ca<'2+>释放和胞外Ca<'2+>内流，16周的糖尿病病组与对照组相比，Ryanodine触发的Ca<'2+>释放和Ca<'2+>内流都显著降低，且达峰时间(TTP)明显延长(P<0.05)；Ryanodine触发的Ca<'2+>释放和Ca<'2+>内流均可引起线粒体Ca<'2+>摄取，导致[Ca<'2+>]m升高。16周的糖尿病病组与对照组相比，Ryanodine触发的Ca<'2+>释放和Ca<'2+>内流引起的[Ca<'2+>]m升高程度明显低于对照组，且达峰时间明显长于对照组。提示：糖尿病情况下，Ryanodine途径触发的Ca<'2+>释放和Ca<'2+>内流明显降低，且Ryanodine触发的Ca<'2+>释放和内流能引起线粒体Ca<'2+>摄取，糖尿病线粒体钙摄取幅度和速度显著降低。
6．线粒体解偶剂CCCP能引起[Ca<'2+>]i升高，糖尿病组[Ca<'2+>]i升高程度明显高于对照组，即从糖尿病线粒体释放的Ca<'2+>多于对照组，提示线粒体存在钙超载；比较线粒体解偶剂CCCP使用前后KCl引起的胞浆Ca<'2+>浓度的变化，发现使用CCCP后对照组KCl引起的[Ca<'2+>]i升高程度显著降低(P<0.05)，而糖尿病组虽有降低的趋势，但无显著性差异，即糖尿病情况下线粒体对KCl诱导的Ca<'2+>内流的影响减小，提示线粒体参与KCl引起的[Ca<'2+>]i的升高过程，糖尿病线粒体钙缓冲能力下降。
7．无钙液中，TG耗竭钙池后，使用线粒体解偶剂CCCP能引起[Ca<'2+>]i升高，糖尿病组[Ca<'2+>]i升高程度明显高于对照组，即从糖尿病线粒体释放的Ca<'2+>多于对照组，提示糖尿病线粒体存在着钙超载；比较线粒体解偶剂CCCP使用前后TG触发的Ca<'2+>池操纵性Ca<'2+>内流的变化，发现使用CCCP后对照组TG触发的[Ca<'2+>]i升高程度显著降低(P<0.05)；而糖尿病组虽有降低的趋势，但无显著性差异，可见糖尿病情况下线粒体对TG触发的Ca<'2+>池操纵性Ca<'2+>内流的影响减小，提示：线粒体参与TG触发的Ca<'2+>池操纵性Ca<'2+>内流过程，且糖尿病线粒体钙缓冲能力。未使用CCCP时，糖尿病组TG触发的Ca<'2+>池操纵性Ca<'2+>内流显著低于对照组，而CCCP使用后两组相比无显著性差异，提示：线粒体在Ca<'2+>池操纵性Ca<'2+>内流过程中发挥重要作用，糖尿病线粒体钙缓冲能力下降是导致糖尿病Ca<'2+>池操纵性Ca<'2+>内流降低的主要。
研究结论：
1．在糖尿病血管平滑肌细胞KCI去极化介导的[Ca<'2+>]i升高明显高于对照组，且KCI在引起[Ca<'2+>]i升高的同时，也可引起[Ca<'2+>]m升高，糖尿病组也明显高于对照组。
2．phe/Ryanodine能触发经由IP3/Ry受体途径的Ca2+释放和胞外Ca2+内流，糖尿病组[Ca<'2+>]i升高的幅度和速度明显低于对照组；phe/Ryanodine触发的Ca<'2+>释放和Ca<'2+>内流可引起[Ca<'2+>]m升高，糖尿病组[Ca<'2+>]m升高的幅度和速度明显也低于对照组。
3．线粒体解偶剂CCCP可降低KCl去极化诱导的Ca<'2+>内流以及TG触发的Ca<'2+>池操纵性Ca<'2+>内流的幅度和速度，糖尿病组降低的幅度明显低于对照组，即糖尿病情况下(2CCP对KCl诱导的Ca<'2+>内流/TG触发的Ca<'2+>池操纵性Ca<'2+>内流的影响减小，提示线粒体参与KCl诱导的Ca<'2+>内流/TG触发Ca<'2+>池操纵性Ca<'2+>内流过程，糖尿病线粒体钙缓冲能力下降。
4．未使用CCCP时，糖尿病组TG触发的Ca<'2+>池操纵性Ca<'2+>内流显著低于对照组，而CCCP使用后，两组相比无显著性差异，提示：线粒体在Ca<'2+>池操纵性Ca<'2+>内流过程中发挥重要作用，糖尿病线粒体钙缓冲能力下降是导致糖尿病Ca<'2+>池操纵性Ca<'2+>内流降低的主要。
5．线粒体解偶剂CCCP能引起线粒体基质的钙释放，导致[Ca<'2+>]i升高，糖尿病情况下，CCCP引起的[Ca<'2+>]i升高程度明显高于对照组，即从糖尿病线粒体释放的Ca<'2+>明显多于对照组，提示糖尿病线粒体存在着钙超载。