Junctophilin 3 （JP3） 和 Junctophilin 4 （JP4）在大脑皮层、海马及小脑高表达,是一类存在于可兴奋细胞中的膜结合蛋白。JP3,4能够连接细胞膜和内质网膜,形成膜连接复合物,对维持胞内钙稳态有着重要作用。研究发现,Jp3,4基因双敲除的小鼠出生后不但出现严重的发育迟缓及致死率高,而且呈现记忆认知功能损伤和运动协调功能失常,提示这两种蛋白在维持动物记忆和运动功能上起重要作用,并在胚胎神经分化发育过程中的不可或缺性。但其在胚胎发育过程的表达变化、功能特征以及功能差异尚未见报道。JP3,4能否在神经分化发育早期便参与神经系统的建立也亟待探索。果蝇表达的JP同源蛋白Undertaker （UTA）,能通过维持吞噬细胞内Ca²⁺平衡来参与凋亡细胞的清理。神经分化过程伴随大量细胞凋亡,未被及时清理的凋亡细胞则会发生二次坏死,导致细胞毒性并影响轴突的生长。凋亡的细胞会释放出"find-me"信号,快速吸引周围的细胞迁移,同时也会暴露出"eat-me"信号,保证吞噬细胞的识别和吞噬。然而,哺乳动物神经组织JPs是否也具有相同的功能迄今未见报道。除了需要严格和适宜的外部环境,神经元极化及轴突生长还受胞外信号的调控。凋亡细胞能够召唤周围细胞的增殖,但是否能对神经极化以及轴突生长产生影响尚未见报道。同时,JP3,4在连接凋亡、吞噬及神经极化之间扮演的角色也亟待阐明。在神经发育初期,未分化的突起通过竞争,最终只形成单一的轴突,而其他的突起将会停止生长或者变成树突,该过程使神经元在形态和功能上都形成了极化。神经元的极化及生长需要局部的Ca²⁺信号和cAMP,形成局部极化。通过TRPC内流的Ca²⁺能够启动轴突的特化,并激活下游CaMKI等级联信号,促使轴突形成。而在轴突切断的外周神经中,钙波会沿着轴突传向胞体,启动轴突的再生。此外,Ca²⁺信号还可以和cAMP通路相互作用形成正反馈,放大cAMP信号。在诸多突起中,cAMP浓度最高的突起能够通过正反馈不断提升内部cAMP浓度,促使该突起长成轴突,而剩下突起则长成树突。然而,胞内cAMP信号如何被唤起,Ca²⁺信号如何在局部区域被精准调控,基于JP3,4维持的胞内Ca²⁺平衡是否与此相关联尚未完全明确。本论文第一部分将对以上问题做出探索。在轴突和树突的生长过程,会有过量的轴突分支、突触以及树突树形成,在形成神经环路后,多余的轴突分支将会被选择性修剪,以保证神经信号传递的专一性。吞噬受体Megf10能够参与中枢神经系统中突触的修剪与重塑,Megf10敲除小鼠则保留了过多数量的突触。果蝇Megf10的同源蛋白Draper已被发现能够参与果蝇胚胎发育过程的吞噬,而UTA则与Draper协同完成这一事件。因此,本论文第二部分（附）探索了JP3,4能否在胚胎干细胞分化神经过程中参与轴突的修剪及重塑。Junctophilin-3,-4连接吞噬参与神经极化作用研究本论文第一部分考察了JP3,4参与神经极化的分子机制,探索JP3,4正常表达与Ca²⁺/cAMP形成局部极化的相关性。实验结果显示,JP3,4在ES细胞定向分化神经元早期有一过性高表达。在ES细胞沉默Jp3和Jp4,其神经分化早期表达显著降低,导致Ca²⁺/cAMP极化正反馈通路受破坏,进而抑制神经极化。抑制JP3,4早期表达高峰使神经前体细胞胞内Ca²⁺分布失去空间特异性,并导致Ca²⁺瞬变能力显著减弱,同时cAMP含量明显下降,cAMP-LKB1-SAD/MAR K2极化通路激活受阻。提示JP3,4早期高表达对维持神经前体细胞胞内局部Ca²⁺/cAMP极化正反馈通路有重要作用。与此同时,ES细胞定向分化神经早期JP3,4一过性高表达尚与吞噬作用密切相关。神经分化过程伴随大量凋亡,抑制JP3,4早期表达致使神经前体细胞清理凋亡细胞的效率显著下降。提示JP3,4在凋亡细胞清理过程需要被大量表达。进一步研究发现,JP3,4能够感应凋亡细胞的信号。凋亡细胞的刺激可快速提高JP4及吞噬受体Megf10的表达水平,并可促进JP3与RyR2、RyR3的结合,同时,JP4与Megf10的结合也显著上调。这些结果提示,除了维持内质网与细胞膜的空间距离,JP3与JP4在功能上各有分工,可分别通过JP3-RyR2,3相互作用及JP4-Megf10相互作用参与吞噬,保证神经极化适宜的微环境。最后,实验结果显示,凋亡细胞刺激可显著提升胞内cAMP的含量并激活cAMP-LKB1-SAD/MARK2极化通路,促进神经元极化。更为重要的是,凋亡细胞的刺激能够提升神经前体细胞胞浆Ca²⁺瞬变能力,易化神经前体细胞极化。该结果提示神经分化发育过程,凋亡细胞可与神经前体细胞建立联系,不仅可诱导其吞噬,同时也能分泌信号促进神经极化及轴突生长,而JP3,4在其中起着桥梁作用。附：JP3,4参与神经分化过程轴突修剪研究本论文第二部分初步探索了JP3,4在神经分化过程参与轴突修剪。实验结果显示,通过慢病毒沉默吞噬受体Megf10可导致d 8+0 JP3的表达下降,而JP4的表达上调。而沉默JP3则导致Megf10的表达上调,沉默JP4导致Megf10的表达轻微下调,同时沉默JP3,4则会上调Megf10的表达。结合第一部分JP3,4与Megf10的免疫共沉淀结果,提示JP3,4与Megf10之间存在调控关系。在d 8+5用凋亡细胞刺激可提升JP4以及Megf10的表达。免疫荧光及电镜结果表明,在d 8+5,细胞的吞噬能力更强,能够同时吞噬2-3个凋亡细胞或者细胞碎片。此外,神经元之间被发现存在相互联系。进一步研究发现,在神经分化d 8+5,β-tubulinⅢ碎片被包裹于Megf10阳性的细胞中。同时,三维重构的结果也显示JP3,4阳性的细胞也能吞噬轴突碎片（β-tubulinⅢ日性）。此外,实验结果也表明,神经元阳性的细胞不会参与吞噬,而JP3,4及Megf10则大部分分布在神经元阳性细胞以及神经前体阳性细胞中,提示可能有表达JP3,4的胶质前体细胞参与轴突修剪。结论：1.ES细胞分化神经前体细胞过程,凋亡细胞能吸引吞噬细胞触发其吞噬作用,并促未成熟神经突极化。JP3和JP4在该过程维持胞内Ca²⁺平衡并耦联这两个关键事件,确保神经突极化的完成。神经分化早期一过性高表达JP3和JP4,不仅为两种进化保守的膜连接蛋白属性,而且存在不同的分工及功能,这些功能在神经轴突形成极化中不可或缺。2.JP3和JP4在神经分化过程中后期参与轴突修剪,并分别与Megf10之间存在调控关系。Megf10及JP4能够参与轴突碎片的吞噬,从一定程度上揭示神经环路形成和完善过程的分子基础,为神经退行性疾病的修复认识提供有益的思路。