【摘 要】
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铜是所有生物体必不可少的辅助因子,浓度超过稳态机制维持的阈值会产生毒性,最直接的是使细菌产生氧化应激,造成细胞损伤。抗氧化防御机制作为细菌体内最重要的解毒机制之一,可抵抗铜造成的氧化损伤。好氧条件下细菌对铜的氧化应激反应及相应的抗氧化防御机制研究较为广泛,缺氧条件下的研究尚不多见。本论文采用对多种重金属具有抗性的兼性厌氧菌C.braakii JPG1为研究模型,探究其抗氧化系统在不同氧条件（好氧/
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铜是所有生物体必不可少的辅助因子,浓度超过稳态机制维持的阈值会产生毒性,最直接的是使细菌产生氧化应激,造成细胞损伤。抗氧化防御机制作为细菌体内最重要的解毒机制之一,可抵抗铜造成的氧化损伤。好氧条件下细菌对铜的氧化应激反应及相应的抗氧化防御机制研究较为广泛,缺氧条件下的研究尚不多见。本论文采用对多种重金属具有抗性的兼性厌氧菌C.braakii JPG1为研究模型,探究其抗氧化系统在不同氧条件（好氧/缺氧）下对铜胁迫的生理生化响应机制与转录调控机制以及在铜的吸附累积过程中发挥的作用,并首次探究了sox R在缺氧条件下的作用。主要研究结果如下:（1）菌株JPG1对好氧/缺氧条件下Cu2+胁迫的氧化应激生理响应。菌株JPG1在缺氧条件下对Cu2+更加敏感,细胞存活数量仅为好氧条件下的10%。Cu2+刺激菌株JPG1产生活性氧自由基（ROS）和超氧阴离子(O2·-),好氧/缺氧条件下的差异主要体现在前48 h:好氧条件下的菌株对Cu2+的反应更迅速,在0 h产生瞬时反应;缺氧条件下的细菌细胞因Cu2+的高毒性及对其的高敏感性,产生的ROS和O2·-更多,对细胞的氧化损伤更强。Cu2+胁迫诱导MDA的形成,缺氧条件下Cu2+诱导的MDA含量约为好氧条件下的1.23-9.02倍。菌株JPG1在缺氧条件下对Cu2+的胁迫更加敏感。（2）菌株JPG1抗氧化系统在好氧/缺氧条件下对Cu2+的转录组响应。无铜好氧-缺氧组（H0-Y0）、好氧加铜组（H0-H1.5）、缺氧加铜组（Y0-Y1.5）中参与抗氧化系统的显著上调差异表达基因数量分别为显著下调的2.00、4.33和2.57倍;氧化还原敏感的转录激活因子（sox R）、转运蛋白（mnt H）在三组中均显著上调差异表达;缺氧条件下谷胱甘肽（GSH）相关显著上调差异表达基因的数量是好氧条件下的2倍;在H0-H1.5、Y0-Y1.5组均存在与过氧化氢（H2O2）和GSH相关的差异表达基因的GO条目;7个GSH相关的显著上调差异表达基因参与GSH代谢通路,表明GSH在抵抗Cu2+的氧化胁迫中发挥重要的作用。（3）菌株JPG1中抗氧化系统关键调控因子sox R作用验证。缺氧条件下编码超氧化物歧化酶（sod A）、富马酸盐水合酶II类（fum C）、烷基氢过氧化物还原酶亚基F（ahp F）、谷胱甘肽S-转移酶（gst B）和Cu-Zn超氧化物歧化酶（sod C）基因的相对表达量增加的倍数比好氧条件下的大,sox R对ahp F和sod C的表达也存在影响,而Δsox R菌株各基因的表达均未被诱导。sox R参与Cu2+、甲萘醌、过氧化氢（H2O2）适应反应。好氧/缺氧条件下,Cu2+胁迫使Δsox R菌株的总抗氧化能力（T-AOC）较野生型（WT）菌株低。对于WT菌株和Δsox R菌株,好氧条件下的T-AOC均为缺氧条件下的2倍左右。好氧/缺氧条件下,WT菌株实验组的锰超氧化物歧化酶（Mn-SOD）活性均高于对照组,而缺氧条件下,对于Δsox R菌株,144 h时其活性在检测线以下,说明sox R基因的缺失导致sod A在缺氧条件下的表达受到更大影响。（4）菌株JPG1在好氧/缺氧条件下对Cu2+的吸附累积特性。缺氧条件下菌株JPG1对0.5和1.5 m M Cu2+的去除率分别高达94.09%、90.57%,是好氧条件的7.24和4.36倍,具有较强的吸附累积Cu2+的能力。在好氧/缺氧条件下,Cu2+在胞内的累积明显高于胞外吸附,1.5 m M Cu2+浓度,胞内累积量分别为胞外吸附量的4.41倍（好氧）和2.14倍（缺氧）,其缺氧条件下的胞内累积量高达好氧条件下的12.20倍。Cu2+胁迫导致GSH含量降低,且缺氧条件1.5 m M Cu2+浓度下的GSH含量比好氧条件下的少,表明菌株JPG1中GSH在胞内结合Cu2+及应对氧化胁迫方面发挥重要作用。综上,研究结果表明Cu2+在缺氧条件下对菌株JPG1的毒性更大;GSH相关基因在Cu2+抗性中发挥更重要的作用;抗氧化系统关键调控因子sox R在缺氧条件下发挥更大的调控作用;菌株JPG1在缺氧条件下对Cu2+的吸附率显著高于好氧条件,且Cu2+在胞内的累积明显高于胞外吸附,这是缺氧条件下Cu2+毒性更大的原因之一,胞内GSH在缺氧条件下消耗得更多,促进了菌株JPG1对Cu2+的解毒。
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