龙芽楤木皂苷对羊毛囊干细胞增殖及肝损伤作用的研究

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实验首先对龙芽楤木皂苷进行提取,并优化其提取方法;其次对羊毛囊干细胞体外进行了分离培养、生物学特性及分化潜能和龙芽楤木皂苷对GHFSCs增殖的影响进行了探讨,为龙芽楤木皂苷在GHFSCs培养方面的应用提供研究依据;最后建立动物肝损伤模型和研究龙芽楤木皂苷及GHFSCs对肝损伤作用的研究,为肝脏疾病的治疗提供理论依据。采用超声波法对龙芽楤木皂苷进行提取,优化提取方法,确定最佳提取条件;采用酶消化法、组织块贴壁法与差速贴壁法分离GHFSCs,用含一定比例BSA及生长因子的全培养基体外模拟山羊体内的生长环境对GHFSCs进行培养,免疫荧光和RT-PCR对GHFSCs表面标记物进行鉴定,向成骨细胞和脂肪细胞进行诱导并鉴定;采用不同浓度的龙芽楤木皂苷对GHFSCs进行培养,探究龙芽楤木皂苷对其增殖的影响,并用RT-PCR法、CCK-8法、EdU-EU法和CFSE法检测GHFSCs增殖情况;构建动物肝损伤模型,采用CCl4溶液对小鼠肝脏进行损伤,分别采用GHFSCs和龙芽楤木皂苷对其进行治疗,取肝组织制作石蜡切片和冰冻切片,光镜下观察组织结构情况,血清学检测各项指标。研究结果表明:1.采用超声波方法对龙芽楤木皂苷提取,通过Design Expert 8.0.6软件分析得出乙醇浓度80%,水浴温度65℃,水浴时间30min条件下龙芽楤木皂苷提取率最高。2.差速贴壁法较优于酶消化法和组织块法,该方法可获得纯度较高的GHFSCs,目前GHFSCs能够传到16代。3.RT-PCR检测GHFSCs特异性基因CD34、CD44、K19、K14呈阳性,免疫荧光检测GHFSCs表面标记物K19、K15、integrinβ1、P63呈阳性,实验分离培养的细胞是GHFSCs。4.通过RT-PCR法、CCK-8法、EdU-EU法和CFSE法检测龙芽楤木皂苷溶液对GHFSCs的增殖情况,发现龙芽楤木皂苷对GHFSCs增殖具有促进作用,且龙芽楤木皂苷溶液浓度为70ug/ml GHFSCs增殖效果最好。5.小鼠肝损伤模型的建立,通过光镜下观察组织切片和血清学检测,发现龙芽楤木皂苷及GHFSCs对肝损伤具有治疗作用,损伤组炎症因子增加,治疗组炎症因子减少接近正常组;实验A和B组,损伤组7d和21d ALT为132U/L和107U/L,而治疗组7d和21d ALT为63U/L和42U/L,接近正常值;损伤组7d和21d AST为254U/L和206U/L,而治疗组7d和21d AST为191U/L和124U/L接近正常值。
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