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目的:探讨人视网膜母细胞瘤(Retinalblastoma, RB)中血管生成拟态(Vesculogenic mimicry, VM)的存在与否;在体外通过三维培养,探讨缺氧在诱导RB细胞向内皮样细胞转化及VM形成中的作用;并利用RNA干扰(RNAi)技术构建针对缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的shRNA慢病毒载体,研究HIF-1α在RB细胞(Y79)形成VM中的调控作用。方法:1.收集人RB临床标本,石蜡切片,HE染色、PAS/CD34双重染色观察RB中是否存在VM,及拟态血管密度(VMD)与肿瘤分期及分化程度的关系;采用免疫组织化学方法检测肿瘤干细胞标记物ABCG2,内皮细胞标记物AC133、特异性低氧反应元件HIF-1α及其下游因子EphA2、MMP-2的表达。2.利用商品化的慢病毒载体Lentivirus构建针对HIF-1α的shRNA病毒载体,转染Y79细胞,72h后在荧光倒置显微镜下观察转染效率,新霉素抗性筛选出稳定转染的Y79细胞,Westenblot及逆转录PCR的方法分别检测HIF-1α蛋白及mRNA的表达。3.在体外对Y79细胞进行缺氧培养;倒置显微镜下观察细胞形态的改变;通过Dil吞噬实验及免疫荧光检测内皮细胞标记物AC133的表达从而对由肿瘤细胞诱导而成的内皮样细胞进行鉴定;免疫荧光显微镜检测肿瘤干细胞与内皮样细胞的关系;通过三维培养观察VM的形成能力;Westernblot及荧光定量PCR的方法检测HIF-1α、EphA2、MMP-2的表达。结果:1.在收集的33例人视网膜母细胞瘤石蜡标本中19例可见PAS阳性而CD34阴性的VM结构,统计分析结果显示未分化型RB的VM阳性率明显高于分化型,而各分期之间VM阳性率无明显差异。免疫组化结果显示:有VM存在的RB组织中可见部分肿瘤细胞ABCG2.AC133阳性表达且分布与VM的走形一致;统计分析结果显示:有VM组ABCG2、AC133阳性细胞百分比明显高于无VM组,并且HIF-1α、EphA2、MMP-2的表达也明显高于无VM组。2.阳性克隆PCR结果及测序结果均显示:针对HIF-1α的shRNA病毒载体构建成功;利用该病毒载体系统转染Y79细胞后未见明显的细胞毒性,抗性筛选出的稳定转染细胞其HIF-1α的蛋白及mRNA表达几乎被完全沉默。3.在体外缺氧培养后,部分Y79细胞失去悬浮生长的特性开始贴壁生长,呈长梭形或多边形;实验显示这些贴壁的细胞具有吞噬Dil-acLDL的功能并能表达AC133;在三维培养基上缺氧能诱导Y79细胞形成网格状VM结构;Westernblot及荧光定量PCR结果显示:缺氧使Y79细胞HIF-1α及其下游因子EphA2、MMP-2的表达明显增加。而在稳定转染HIF-1αshRNA的Y79细胞中未能观察到缺氧引起的上述变化。结论:1.低分化的RB组织中存在VM,且VM的密度与分化程度呈反比与临床分期无关。2.设计构建的HIF-1αshRNA慢病毒载体稳定转染Y79细胞后可以有效地实现对相应的内源性HIF-1αmRNA的降解。3.缺氧是RB血管生成拟态的主要诱导因素之一,HIF-1αshRNA慢病毒在体外具有抑制缺氧诱导Y79细胞形成拟态血管的作用。4.VM形成中的内皮样细胞可能来源于RB细胞中的干细胞。