摘要：论文根据本实验室鉴定的DPV UL46基因(GenBank登录号EU195108)开展了如下系列研究：克隆UL46基因并对其分子特性进行生物信息学分析、原核表达、多克隆抗体的制备、转录时相及表达时相分析、DPV UL46蛋白属性分析和基于UL46蛋白多克隆抗体检测DPV抗原的双抗体夹心ELISA法的建立等,获得如下结果：1.DPV UL46基因的分子特性DPV UL46大小为2220bp,编码739aa,在20～500aa处存在一个Herpes_UL46结构功能域,属于疱疹病毒UL46蛋白家族,在17～470aa范围内存在大量的一致性序列,尤其是在356-413aa区段,显示了高度的保守性。在单一氨基酸位点上,Gln372、Asn376、Tyr382和Trp385完全保守。DPV UL46基因与24个疱疹病毒参考株UL46基因的氨基酸同源性均不高,系统进化树分析显示其与α-疱疹病毒亚科中的MDV-2和GaHV-3等鸟类疱疹病毒的亲缘关系最近,与其他疱疹病毒关系较远,揭示DPV应该被划为α疱疹病毒亚科中单独的一类。DPV UL46基因存在10个转录启动子序列。UL46编码蛋白共有35个抗原表位,分布于UL46多肽链的整个序列中,但主要位于氨基端Ser423～Thr449、Va1451～Ser500、Phe502～Tyr526、Asn540～Thr596、Glu614～Ala651、Ser655～Ser671、Gly681-Cys700区域。编码的多肽链中亲水区域大于疏水区域,具有较好的亲水性、可塑性和较高的抗原指数,无跨膜区域,是一种膜外蛋白,定位于细胞质的核周区,无信号肽切割位点,成熟蛋白即为739aa,具有72个潜在的磷酸化位点,2个潜在的糖基化位点。密码子偏嗜性分析表明DPV UL46基因对编码的氨基酸Trp、Met、His、Lys、Glu具有一定的偏嗜性。编码蛋白的结构多为柔性区域,富含a螺旋和p折叠,含少量无规则卷曲。同源模建分析,未发现与该蛋白相匹配的三级结构。该分析结果对进一步开展DPV UL46基因生物学功能的研究具有一定的参考作用。考虑到DPV UL46基因序列较长,同时结合后续的应用,根据抗原性和亲水性等分析结果,确定编码DPV UL46基因的主要抗原域的基因序列位于699～2220bp,将其命名为DPV UL46M。2. DPV UL46和DPV UL46M基因的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备根据DPV UL46基因序列(GenBank登录号EU195108)分别设计两对引物P1／P2(含有BamHI和XhoI酶切位点,扩增幅度为2558bp,含完整的DPV UL46基因)和P3／P4(针对UL46M基因,含有BamHI和XhoI酶切位点,扩增幅度为1522bp),PCR、双酶切和测序结果均表明目的片段成功的得以克隆。通过对pMD18-T/UL46和pMD18-T/UL46M及pET-32a (+)进行BamHI、Xhol双酶切和连接,构建了重组表达质粒pET-32a (+)/UL46和pET-32a (+)/UL46M,并转化入E.coli Rosetta感受态细胞中。经IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE分析表明主要抗原域区段得以顺利表达,表达产物以包涵体形式存在,相对分子量约为79kD。优化出最佳表达条件：IPTG浓度为0.2mmol/L,在E.coli Rosetta中37℃诱导4h。而DPV UL46完整基因表达失败。用经过镍柱亲和层析而获得的较高纯度的重组蛋白来免疫家兔以制备兔高免血清,Western blot方法显示制备的多克隆抗体能与融合蛋白特异性的结合,琼扩实验显示制备的多克隆抗血清效价达1：8。基于兔抗DPV UL46M IgG的Dot-ELISA方法检测DPV与其他毒／菌株,结果显示,该抗体能与DPV特异性的结合,而与其他的毒／菌株均呈现阴性反应,这为进一步深入研究UL46的功能奠定了基础,同时也为进一步进行表位疫苗开发和DPV分子诊断技术建立提供了科学材料。3. DPV UL46基因的转录时相和表达时相分析根据DPV UL46基因和鸭P-actin内参基因序列分别设计了目标基因引物U3／U4(扩增幅度为121bp)和内参基因引物U1／U2(扩增幅度为178bp)。在测定完UL46基因的标准曲线和熔解曲线后,提取感染DPV后的2h、4h、6h、8h、12h、18h、24h、30h、36h、42h、48h、54h、60h、66h、72h和80h不同时间段的DEF mRNA并进行反转录,然后以cDNA为模板,SYBR Green I染料法进行荧光定量PCR扩增。结果表明,UL46基因的转录在12h左右时开始增加,随着时间的延长,转录量逐渐增加,在24h左右显著增加并在54h左右达到峰值,此后表达量逐渐降低。收集感染DPV不同时间段的DEF,反复冻融3次裂解细胞并提取病毒蛋白,使用纯化后的兔抗UL46M IgG通过Western blot对DPV感染的DEF中的UL46蛋白的表达时相进行分析,结果显示DPV UL46蛋白感染宿主细胞后12h可见约81.8kD的特异性条带,随时间推移表达量逐渐增多,在60h左右达到最大值,符合晚期基因的表达谱特征,同时与UL46基因的转录时相相符。转录时相和表达时相结果说明UL46基因的转录表达规律符合基因由转录到翻译的生命周期规律,且具有先转录后表达的模式,也表明了DPV UL46基因是一个晚期基因。4. DPV UL46蛋白的属性分析感染DPV后25h时收集DEF,低速离心并经PBS清洗,NP-40破碎细胞后取上清和沉淀分别进行Western blot,结果发现,能够与兔抗DPV UL46M IgG特异性结合并出现大小与目的蛋白相符的条带的是不溶于NP-40的沉淀部分,由此可以证实DPV VP11/12是DPV的结构蛋白,是皮层的组成部分之一5.双抗体夹心ELISA检测方法的建立与应用以纯化的兔抗DPV UL46M IgG为第一抗体,纯化的小鼠抗DPV IgG为夹心抗体,建立并优化检测DPV的双抗体夹心ELISA方法。结果表明：最佳反应条件为兔抗DPV UL46M IgG和小鼠抗DPV IgG的稀释度分别为1：320和1：20,酶标抗体的稀释度为1：5000,可检出52ng纯化的DPV。应用建立的双抗体夹心ELISA方法检测可疑病料,并与常规PCR作比较,结果显示建立的方法特异、敏感性好,适用于DPV的快速、批量、特异性检测。