目的:p53基因是最早期发现的抑癌基因中的一员,是目前已知的与人类恶性肿瘤关联度最密切的基因之一。p53基因定位于人染色体短臂17p13.1区,全长约16~20Kb,由11个外显子和10个内含子共同构成,编码393个氨基酸组成的核内磷酸蛋白,其转录产物为25Kb mRNA。野生型p53(wtp53)是抑癌基因,其在包括细胞周期、细胞凋亡、衰老、基因稳定性及血管生成的抑制等多种细胞过程中均起着至关重要的作用。作为抗癌防御机制的主要组成部分,p53在人类肿瘤中通常发生了突变。细胞通常被突变型p53(mtp53)所刺激进行分裂,发挥癌基因作用。已有研究发现,包括呼吸系统、泌尿系统、生殖系统、消化系统等多个系统发生的原发肿瘤都与p53基因突变相关。基因多态性是一种较常见的基因变异。这种变异会导致相同基因编码产物的功能不同、导致对个体对疾病的易感性、对药物的敏感性与耐受性、临床表现的多样性、疾病转归及预后等遗传性状表型不同。研究发现,除了突变之外,p53基因尚具有多态性。根据目前文献报道,在p53基因启动子区,第1,2,3,6,7,10内含子区及第7外显子区至少可以检测到8个多态性位点。其中三个多态位点与肿瘤的发生有关,包括p53基因72密码子Arg/Pro多态性与多种肿瘤的遗传易感性有关;P53基因第3内含子区16bp插入重复序列多态性与肿瘤有关;p53基因第6内含子的MSP I限制性酶切位点多态性与肿瘤有关。结直肠癌(CRC)是世界上第3大常见的肿瘤类型,在中国,有超过7%的总体癌症相关死亡是由结直肠癌导致的。低位直肠癌(LRC)指的是位于肛缘8厘米内的结直肠癌。与中段及上段直肠癌相比,低位直肠癌在手术难度、病理学类型及患者结局上的差异均较大。尽管对于低位直肠癌的治疗有所改善,对其生物学机制的了解也有所加深,但由于其局部复发风险较高,低位直肠癌仍然是人类健康的一大挑战。在结直肠癌中已有关于p53基因单核苷酸多态性(SNPs)的报道。然而,之前的研究中,绝大多数并未在肿瘤部位的基础上对结直肠癌进行分类,或者仅仅将结直肠癌分为结肠癌和直肠癌,且其研究结果存在不一致甚至相互矛盾。例如,rs1042522是结直肠癌中研究得最多的p53功能性SNPs之一,其可导致72密码子的精氨酸变为脯氨酸。Gemignani等的研究表明rs1042522与结直肠癌之间无显著相关关系。而与之相反的是,亚洲的两个研究小组均证实了rs1042522多态基因型与结直肠癌的发病风险增加相关。Song等人的研究结果表明rs1042522基因型与吸烟或饮酒之间无显著的相关性,而Zhu等的研究表明72P等位基因可增加饮酒者的结直肠癌发病风险。最近的一项研究对既往发表的32篇文献的数据进行了更新的荟萃分析,结果表明rs1042522基因多态性并不显著增加总人群的结直肠癌发病风险。值得注意的是,当研究人群仅限于直肠癌患者时,rs1042522的CC基因型与直肠癌的发病风险增加显著相关,提示肿瘤的原发部位可能对p53 SNPs与结直肠癌发病风险之间的关系起着重要的影响作用。综上,尽管以往对p53基因丢失、突变、蛋白的过度表达与肿瘤的关系已经做了大量研究,关于p53基因多态性的研究尚处于起步阶段,各实验结果尚存在争议。关于P53基因多态性及其差异表达与低位直肠癌发病风险,生物学行为以及预后的关联研究尚未见报道。本研究通过开展以中国北方人群为基础的病例-对照研究,系统探讨P53基因多态与低位直肠癌发病风险、生物学行为及预后的关系,探讨其与吸烟、饮酒等低位直肠癌环境因素之间是否存在交互作用,探讨p53基因多态对P53蛋白表达的影响及P53蛋白差异表达与低位直肠癌生物学行为及预后之间的关系,为实现低位直肠癌术前评估及个体化治疗提供理论基础及实验依据依据。研究方法:1、研究病例的选择本研究经中国医科大学附属第一医院伦理委员会批准,并与患者签署了知情同意书。选取中国医科大学附属第一医院肛肠外科2011年12月—2016年6月收治的诊断为直肠癌,且肿瘤距离为距肛缘8cm以内的患者为研究对象350例,为低位直肠癌病例组。以同一时期收入院,诊断为肛门良性疾病,经指检及相关检查无低位直肠恶性肿瘤患者350例,为良性对照组。患者术前均采集空腹静脉血,分离血清和凝血块后-20℃保存待测。实验组纳入标准:1,明确诊断为直肠癌,且肿瘤距肛缘8cm以内2,选取年龄范围为18周岁以上的成年人实验组排除标准:1,排除自身免疫系统疾病患者2,排除结核等传染性疾病患者3,排除术前伴发有其他脏器原发性肿瘤患者4,排除术前新辅助放化疗患者2、p53基因候选多态位点的选择根据NCBI dbSNP和HapMap数据库公布的最新数据,采用软件预测方法选取,依据多态位点在中国人群中存在一定的频率分布,最小等位基因频率(MAF)>5%的标签SNPs(tagSNPs)进行研究靶点筛选。进一步参考相关文献选择已有报道与疾病相关,但未在肿瘤以及低位直肠癌中报道过的多态位点作为研究对象。最后确定p53 rs1042522、p53 rs12947788、p53 rs1625895、p53 rs2909430、p53 rs12951053等5个tagSNPs,探讨其与低位直肠癌发病风险、临床生物学行为及预后的相关性。3、p53基因SNP测序分型通过Kasp方法对347例低位直肠癌病例组与353例对照组进行p53 rs1042522、p53 rs12947788、p53 rs1625895、p53 rs2909430、p53 rs12951053这5个位点测序。4、p53基因SNP分型与低位直肠癌发病风险关联分析采用卡方检验计算对照组中Hardy–Weinberg平衡(HWP)以检验期望频率。采用卡方检验评估p53基因多态性与低位直肠癌发病风险的相关性。采用Logistic回归模型计算每一个基因型及基因组模型的优势比(ORs)及其95%置信区间(CI)。采用Logistic回归模型评估SNPs与经典危险因素,包括性别、年龄、吸烟状态、饮酒状态之间的相互作用。采用online SHEsis方法进行单体型分析。5、病例组临床病理信息采集根据术后病理报告收集临床生物学行为信息,包括淋巴结转移,TNM分期,浸润深度,生长方式,组织类型,脉管癌栓,神经节侵犯,结外肿瘤种植,癌周淋巴细胞浸润等。6、p53基因SNP分型与低位直肠癌生物学行为的关联分析p53基因SNP分型与低位直肠癌临床病理参数的关系均用非参数秩和检验(Mann-Whitney U test)。采用Logistic回归模型评估SNPs与经典危险因素,包括性别、年龄、吸烟及饮酒状态之间的相互作用。7、病例组临床随访定期随访病例组术后生存及死亡情况,包括无复发生存期(RFS)和总体生存期(OS)等。采用问卷调查形式收集每例受试者及对照组的基本信息,这些基本信息包括性别、年龄以及吸烟和饮酒状态(吸烟史定义为每天至少一支,且持续时间至少1年。饮酒史定义为酒精摄入量平均每天至少50g,且持续时间至少1年)。通过病历资料及手术记录采集低位直肠癌患者的详细临床信息,包括肿瘤-淋巴结-转移(TNM)系统分类、浸润深度、生长方式、组织学类型、癌淋巴细胞浸润状态、神经旁的浸润状态、脉管癌栓、淋巴结转移状态及结外肿瘤种植状态等。在本研究中,所测量的结局变量包括截止到2016年8月21日的随访周期中所统计的总体生存率(OS)及死亡日期。由于在随访过程中有43例失访,最终获得304例受试者生存信息。8、p53基因SNP分型与低位直肠癌预后的关联分析在亚组分析中,排除了上述任一变量的数据有缺失的受试者。采用Cox比例风险模型进行死亡相关风险的单因素及多因素分析。采用COX回归曲线对每一个p53基因多态性的生存曲线进行描绘。Log-rank检验用于评估在亚组中不同患者总体生存率(OS)差异的显著性。采用SPSS 20.0版(SPSS Inc.美国芝加哥IL)软件进行统计学分析。所有检验的显著水平均设定为双侧p<0.05。9、p53基因多态--环境因素交互作用与低位直肠癌发病风险、生物学行为及预后的关联分析通过问卷调查方法收集病例组患者吸烟及饮酒资料。经性别、年龄进行调整,采用全因子模型计算基因分型与吸烟及饮酒的交互作用总P值。10、P53蛋白免疫组化染色及评分采用免疫组化方法检测347例低位直肠癌P53蛋白表达情况。依照双盲法原则,由病理医师独立阅片及评分,评分结果不一致时请上级医生会诊以达成共识。采用计数方法对结果进行判断。每一张病理切片先置于低倍镜下进行全片观察,在低倍镜视野下选取P53抗体阳性染色区,然后置于高倍镜下进行观察。随机选10个高倍视野,每个视野下计数100个肿瘤细胞,取平均数值为该样本免疫组化阳性表达率。P53蛋白在肿瘤细胞中有阳性表达,定位于肿瘤细胞的细胞核,高倍镜下呈现为棕黄色颗粒状。P53的判定结果为:每例样本中阳性细胞数所占比例<10%为阴性(-);10%~30%为(+);30%~50%为(++);50%~100%为(+++)。11、p53基因多态变异对P53蛋白表达的影响分析在同一疾病组内,以不同p53基因多态型分组进行P53蛋白表达的差异分析。采用卡方检验统计p53基因多态对P53蛋白表达的影响,双侧P值<0.05为有统计学意义。12、P53蛋白差异表达与低位直肠癌发病风险、生物学行为及预后的关联分析采用SPSS 20.0版(SPSS Inc.美国芝加哥IL)软件进行统计学分析。P53蛋白表达与低位直肠癌临床病理参数的关系均用卡方检验。生存时间的组间比较用Log-rank检验。双侧P值<0.05为有统计学意义。结果:1、p53基因SNP分型与低位直肠癌发病风险关联分析对5个候选的p53基因SNP分型与低位直肠癌发病风险的关联分析发现,p53rs12947788的等位基因变体A携带者(AA+GA vs.GG)发生低位直肠癌的风险增加(OR=1.393,95%CI 1.030-1.884,P=0.032)。除此之外,其他基因型均与低位直肠癌的发病风险无显著相关。当根据危险因素将研究人群进行分层时,发现5个候选的SNPs中,有3个与低位直肠癌发病风险增加相关。在隐性模型中,rs1042522(CC vs.CG+GG)增加吸烟者发生低位直肠癌的风险(OR=2.561,95%CI1.146-5.721,P=0.022)。在显性模型中,rs12947788(AA+GA vs.GG)可显著增加有饮酒史人群(OR=3.235,95%CI 1.158-9.040,P=0.025)或是年龄小于60岁人群(OR=1.749,95%CI 1.113-2.748,P=0.015)患低位直肠癌的风险。在隐性模型中,相对于杂合基因型及野生型基因,rs12951053的CC基因型的同源性变体携带者(CC vs.CA+AA)与男性低位直肠癌发病风险增加有一定相关性(OR=2.473,95%CI1.061-5.765,P=0.036)。2、p53基因SNP分型与低位直肠癌生物学行为的关联分析对5个候选的p53基因SNP分型与低位直肠癌临床生物学行为进行关联分析,包括肿瘤-淋巴结-远处转移(TNM)分类系统、浸润深度、组织学类型、癌旁淋巴细胞浸润状态、神经节浸润状态、脉管癌栓、淋巴结转移及结外肿瘤种植状态之间的关系分析。结果发现在显性模型中,rs12947788(AA+GA vs.GG)与低位直肠癌的组织学类型显著相关(P=0.044)。进一步亚组分析发现,rs12947788与60岁以上人群(P=0.043)、男性(P=0.022)、无饮酒史(P=0.048)及有吸烟习惯(P=0.039)的低位直肠癌患者的组织学类型显著相关。3、p53基因SNP分型与低位直肠癌预后的关联分析对5个候选的p53基因SNP分型与低位直肠癌预后的关联分析,在总体人群中未发现其与低位直肠癌患者的预后相关。然而,在基于一些临床特征的亚组分析中,发现多种p53基因多态性的杂合基因型携带者与低位直肠癌患者预后相关。对巢状生长模式的低位直肠癌患者来说,rs12947788是其预后好的相关因素(GA vs.GG:HR=0.204,95%CI 0.042-0.980,P=0.047),而rs1625895(GG vs.GA:HR=26.189,95%CI 2.399-285.91,P=0.007)和rs2909430(AA vs.GA:HR=7.284,95%CI1.361-38.996,P=0.020)则是其预后差的相关因素。此外,对女性患者(AA vs.CA:HR=4.170,95%CI 1.017-17.106,P=0.047)、年龄小于60岁的年轻患者(AA vs.CA:HR=3.561,95%CI 1.192-10.638,P=0.023)、有吸烟史患者(AA vs.CA:HR=4.940,95%CI 1.178-20.718,P=0.029)、淋巴结转移阳性患者(AA vs.CA:HR=2.367,95%CI 1.028-5.453,P=0.043)或生长模式呈浸润状态(AA vs.CA:HR=3.007,95%CI1.271-7.115,P=0.012)的低位直肠癌患者来说,rs12951053是其预后差的相关因素。4、p53基因5个SNP单体型与低位直肠癌发病风险,生物学行为及预后关联分析由于本研究选择的5个多态位点位于同一基因,我们进一步对其进行了单体型分析。结果发现,C-A-G-A-A单体型对低位直肠癌发病存在风险(P=0.001,OR(95%CI)=4.15(1.63-10.58))。5、p53基因多态--环境因素交互作用与低位直肠癌发病风险、生物学行为及预后的关联分析本研究在探讨单一p53基因5个SNP与低位直肠癌相关性的基础上,进一步探讨了p53基因5个多态位点及其与吸烟饮酒等环境因素交互作用与低位直肠癌发病风险,生物学行为及预后的相关性。结果发现p53基因5个多态与吸烟、饮酒等环境因素相交互未见显著统计学意义(p>0.05)。6、p53基因多态变异对P53蛋白表达的影响分析p53_rs1042522多态与P53蛋白表达之间存在相关性(CG vs GG P=0.027,CC+CG vs GG P=0.032)。p53_rs1042522多态携带者突变型P53蛋白表达阳性率明显高于其他基因型。7、P53蛋白差异表达与低位直肠癌生物学行为及预后的关联分析我们分析了P53蛋白表达情况与低位直肠癌的临床病理参数,包括肿瘤-淋巴结-远处转移(TNM)分类系统、浸润深度、组织学类型、癌旁淋巴细胞浸润状态、神经节浸润状态、脉管癌栓、淋巴结转移及结外肿瘤种植状态之间的关系。经过分组卡方检验后,P53蛋白表达在总体人群中与临床病理参数均未发现显著相关性。分层分析后发现在吸烟的低位直肠癌患者中淋巴结转移与P53蛋白表达存在相关性(P=0.032)。在60岁以上患者中,低位直肠癌的组织类型,TNM分期,肿瘤浸润深度等均与P53蛋白表达相关(P=0.002,P=0.049,P=0.034)。即低分化肿瘤显著高于高分化肿瘤,Ⅲ-Ⅳ期显著高于Ⅰ-Ⅱ期,T3-4期高于T1-2期。在女性患者中,P53蛋白表达与TNM分期相关。即Ⅲ-Ⅳ期女性患者P53蛋白表达水平显著高于Ⅰ-Ⅱ期。在不吸烟患者中,P53蛋白表达与低位直肠癌组织学类型存在相关性。即,低分化肿瘤P53蛋白表达水平显著高于高分化肿瘤。运用Log-rank检验分析了不同组间低位直肠癌患者的生存情况。单因素生存分析结果表明,P53蛋白表达的高低与低位直肠癌总生存期存在显著相关性。即P53蛋白低表达患者的生存期明显长于高表达患者(P=0.028,HR=2.071,95%CI=1.083-3.958)。多因素生存分析结果表明,P53蛋白表达的高低与结肠癌总生存期无显著相关性(P=0.195,HR=1.580,95%CI:0.791-3.154)。按照低位直肠癌经典危险因素(性别、年龄、吸烟及饮酒状态)单因素分层分析后发现女性患者及不吸烟患者P53蛋白低表达者比高表达者生存期更长(P=0.042、HR=3.280、95%CI=1.043-10.311,P=0.014、HR=2.724、95%CI=1.223-6.066)。对60岁以上患者进行多因素分析后发现,P53低表达者比高表达者拥有更长的生存期(P=0.021、HR=3.425、95%CI=1.208-9.712)。结论:1、p53rs12947788的等位基因变体A携带者发生低位直肠癌的风险增加。在隐性模型中,rs1042522可增加吸烟者发生低位直肠癌的风险。在显性模型中,rs12947788可显著增加饮酒者或是年龄小于60岁人群患低位直肠癌的风险。在隐性模型中,相对于杂合基因型及野生型基因,rs12951053的CC基因型的同源性变体携带者与男性低位直肠癌发病风险增加有一定相关性。显性模型中,rs12947788与低位直肠癌的组织学类型显著相关。rs12947788与60岁以上人群、男性、无饮酒史及有吸烟习惯的低位直肠癌患者肿瘤的组织学类型显著相关。而rs1625895和rs2909430则是其预后差的相关因素。在女性、年龄小于60岁、有吸烟史、淋巴结转移阳性或生长模式呈浸润状态的低位直肠癌患者来说,rs12951053是其预后差的相关因素。p53基因C-A-G-A-A单体型增加低位直肠癌发病风险。2、p53基因5个多态与吸烟、饮酒等环境因素交互作用对低位直肠癌风险、行为及预后无明显影响。3、p53_rs1042522多态与P53蛋白表达之间存在相关性。p53_rs1042522多态携带者突变型P53蛋白表达阳性率明显高于其他基因型。4、突变型P53蛋白在低分化低位直肠癌中显著高于高分化低位直肠癌,在Ⅲ-Ⅳ期中显著高于Ⅰ-Ⅱ期,在T3-4期中高于T1-2期。在女性患者中,Ⅲ-Ⅳ期低位直肠癌P53蛋白表达水平显著高于Ⅰ-Ⅱ期低位直肠癌。突变型P53蛋白低表达患者的生存期明显长于高表达患者。女性患者及不吸烟患者P53蛋白低表达者比高表达者生存期更长。60岁以上患者,P53蛋白低表达者比高表达者拥有更长的生存期。