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目的甲状腺癌(thyroid carcinoma,TC)已成为内分泌系统中最常见的恶性肿瘤,但其具体的分子机制尚不十分明确。本研究主要着手于LncRNAGas5基因,从以下三个方面逐步探索其在甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)中具体的作用机制。(1)明确Gas5在PTC组织及细胞系中的表达情况以及过表达Gas5后对PTC细胞增殖的影响。(2)明确miR-222-3p在甲状腺乳头状癌细胞中的表达以及对PTC细胞增殖的影响。(3)探讨Gas5抑制甲状腺乳头状癌细胞增殖的具体分子机制。该研究将为甲状腺乳头状癌的临床治疗提供一个参考的方案。方法(1)利用Oncomine数据库分析了Gas5在PTC组织中的表达情况。采用qRT-PCR方法检测了在PTC的四种细胞系(BHP5-16,K1,BHP2-7,TPC)和正常甲状腺细胞(Nthy-ori 3-1)中Gas5的表达水平。随后选择甲状腺乳头状癌BHP5-16和K1细胞系作为实验对象,并且利用qRT-PCR方法检测了BHP5-16和K1细胞中内源性miR-222-3p mRNA的表达水平。(2)在两种细胞系中利用Lipo2000转染Gas5质粒后,行MTT、克隆形成实验以及体内的肿瘤形成实验检测了BHP5-16和K1细胞增殖能力的变化。通过生物信息学软件预测Gas5是miR-222-3p的靶基因,并通过双荧光素酶实验进行验证。(3)在BHP5-16和K1细胞系中利用Lipo2000转染miR-222-3p mimics或miR-222-3p inhibitor,行MTT和克隆形成实验检测了细胞活性的改变。生物信息学软件预测PTEN也是miR-222-3p的靶基因,并通过qRT-PCR、western blotting及双荧光素酶实验进行验证。(4)在BHP5-16和K1细胞系中,利用Lipo2000共转染Gas5和miR-222-3p mimics后,通过western blotting方法检测PTEN蛋白及其下游Akt和P-Akt蛋白水平。双荧光素酶实验进一步验证Gas5能够发挥ceRNA作用,抑制miR-222-3p与PTEN的结合。结果(1)Gas5在PTC组织和细胞中均呈现显著低表达。(2)与对照组(Gas5-nc)比较,体外的MTT和克隆形成实验及体内的甲状腺乳头状癌移植性实体瘤形成实验均提示,过表达Gas5后可显著抑制PTC细胞的增殖。通过双荧光素酶实验可以看出,转染psiCHECK-2-Gas5-WT质粒的细胞中,共转染miR-222-3p mimics组与共转染miR-nc组相比,其荧光素酶的活性明显受到抑制(P<0.05);转染psiCHECK-2-Gas5-MT质粒的细胞中,共转染miR-222-3p mimics组与共转染miR-nc组比较,两组荧光素酶的活性值无显著性差异(P>0.05)。提示Gas5为miR-222-3p的靶基因。(3)QRT-PCR结果显示BHP5-16和K1细胞中内源性miR-222-3p的mRNA表达水平均较正常甲状腺细胞显著升高(P<0.05)。MTT和克隆形成实验结果显示:与对照组(miR-nc)比较,转染miR-222-3p mimics的BHP5-16细胞和K1细胞,细胞增殖能力明显增加;转染miR-222-3p inhibitor的BHP5-16细胞和K1细胞,细胞增殖能力明显下降(P<0.05)。QRT-PCR实验结果表明转染miR-222-3p mimics后,BHP5-16细胞和K1细胞内PTEN mRNA的表达水平与对照组(转染miR-nc组)比较,无显著性差异(P>0.05)。Western blotting实验结果表明,转染miR-222-3p mimics后,BHP5-16细胞和K1细胞内PTEN蛋白的表达较miR-nc转染组明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。相反,与对照组相比,miR-222-3p inhibitor转染组细胞内PTEN蛋白的表达明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。双荧光素酶实验结果显示,转染psiCHECK-2-WT-PTEN质粒后,与共转染miR-nc组比较,共转染miR-222-3p mimics组荧光素酶的活性明显受到抑制,差异具有统计学意义(P<0.05);转染psiCHECK-2-MT-PTEN质粒后,共转染miR-222-3p mimics组与共转染miR-nc组比较,两组荧光素酶的活性无显著性差异(P>0.05)。表明PTEN也是miR-222-3p的靶基因。(4)Western blotting实验表明过表达Gas5后,BHP5-16细胞和K1细胞内PTEN的蛋白水平较对照组明显上升,P-Akt蛋白水平明显下降(P<0.05)。而当同时给予过表达Gas5和miR-222-3p mimics干预后,相比较于miR-222-3p mimics单独干预组,BHP5-16细胞和K1细胞内PTEN蛋白的表达有所升高,同时P-Akt蛋白的表达下降(P<0.05)。双荧光素酶实验结果显示,对BHP5-16及K1细胞均共转染psiCHECK-2-PTEN-3′-UTR-WT、miR-222-3p mimics和pcDNA3.1/Gas5后,细胞内荧光素酶活性均较共转染psiCHECK-2-PTEN-3′-UTR-WT、miR-222-3p mimics和pcDNA3.1组显著升高(P<0.05)。结论Gas5能明显抑制甲状腺乳头状癌细胞的增殖。MiR-222-3p可通过调控PTEN/Akt信号通路促进甲状腺乳头状癌细胞的增殖;Gas5和PTEN均为miR-222-3p的靶基因,Gas5可发挥ceRNA的作用,与PTEN竞争结合miR-222-3p,促进PTEN/Akt信号通路活化,发挥抑制细胞增殖作用。