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跨膜离子通道样蛋白家族(transmembrane channel-like protein,TMC),包括8个成员TMC1-TMC8。根据基因同源性又可进一步分为3个亚家族,如TMC1-TMC3属于A亚家族,TMC5和TMC6(EVER1)属于B亚家族,TMC4、TMC7和TMC8(EVER2)属于C亚家族。一直以来人们对TMC家族本身是否为离子通道存在争议,已有研究表明在哺乳动物中突变TMC1和TMC2可导致耳聋,证明了在内耳毛细胞中TMC1和TMC2对听觉的产生有重要意义。除了听觉之外,TMC蛋白可能还参与其他感觉的调节。背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)是机体的初级感觉神经元,其轴突末梢可感知外界机械、化学和温度等刺激,形成神经冲动传至大脑高级中枢,产生相应的感觉。在前期研究中,我们通过RNAscope技术在m RNA水平证实了DWSA7在大鼠初级感觉神经节DRG神经元中有较高水平的表达,我们推测DWSA7基因有可能参与DRG神经元对外界环境刺激的感知。辣椒素受体TRPV1(transient receptor potential vanilloid)是非选择性阳离子通道,主要表达在DRG的中小直径感觉神经元中。它作为感受外界刺激的感受器对辣椒素,伤害性热(>43℃),酸(p H<5.9)敏感。通过伤害性刺激激活TRPV1引起内向阳离子电流,引发伤害性感受器DRG神经元动作电位,然后将疼痛感受传入脊髓背角,TRPV1被认为是伤害性感受的重要参与者。在前期实验中我们通过单细胞PCR技术,检测94个DRG神经元细胞中20种基因的表达情况,发现DRG神经元中DWSA7与TRPV1在转录水平有较多的共表达。并且通过RNAscope技术,利用m RNA探针同时检测DWSA7与TRPV1的RNA生物标志物,观察DWSA7与TRPV1在DRG神经元共定位高达51.3%。基于这些结果,我们推测在大鼠DRG中DWSA7蛋白和TRPV1通道之间可能存在某些功能上的关联。为了证实这一推测,本文将从以下四个方面进行重点研究:1研究DWSA7-KO大鼠与野生大鼠相比热辐射刺激下的行为学改变;2DWSA7敲除对大鼠DRG中TRPV1通道表达的影响;3 DWSA7蛋白对TRPV1通道功能的影响;4 DWSA7与TRPV1相互作用机制的初探。目的:探究DRG神经元中DWSA7蛋白对TRPV1通道的影响方法:(1)通过CRISPR/cas9技术得到DWSA7基因敲除(KO)的Sprague-Dawley(SD)大鼠,应用热辐射刺痛仪,测定DWSA7-KO与野生(WT)SD大鼠的热刺痛阈值。(2)通过RT-PCR、Western-blot以及免疫荧光方法,在RNA水平和蛋白水平检测DWSA7和TRPV1在SD大鼠DRG中的表达。(3)通过钙成像方法检测DWSA7-KO大鼠与WT大鼠DRG细胞由TRPV1激动剂辣椒素capsaicin引起的钙信号反应。(4)在HEK293T细胞系中共转DWSA7+TPRV1与单转TRPV1,通过膜片钳电生理记录方法记录给予capsaicin药物激活TRPV1通道后引起内向电流。(5)在HEK293T细胞中同时过表达DWSA7-myc与TRPV1后收集蛋白样品,通过免疫共沉淀(CO-IP)的方法检测DWSA7和TRPV1二者之间是否有直接相互作用。(6)统计方法:两样本t检验,Pearson卡方检验。结果:(1)DWSA7-KO大鼠与野生大鼠相比热辐射刺激下的行为学改变:在基础状态下,DWSA7敲除雌性大鼠的热痛阈值(18.59±1.32 s)与SD野生雌性大鼠(14.41±0.92 s)相比升高(*P<0.05)。DWSA7敲除雄性大鼠的热痛阈值(17.73±1.91 s)与SD野生雄性大鼠(10.62±1.45 s)相比也明显升高(**P<0.01)。(2)DWSA7敲除对大鼠DRG中TRPV1通道表达的影响:通过RT-PCR技术和Western-blot技术,分别在RNA水平和蛋白水平证明WT雌雄大鼠DRG中DWSA7或TRPV1的表达水平相当;DWSA7-KO并不影响大鼠DRG中TRPV1的表达。(3)DWSA7蛋白对TRPV1通道功能的影响:(i)通过钙成像的方法证明野生大鼠DRG神经元对capsaicin有反应细胞的阳性率为65.72%,DWSA7敲除大鼠对capsaicin有反应细胞的阳性率为63.83%。WT大鼠DRG神经元在capsaicin诱导下的钙变化曲线下面积△F×s为19611.69±1642.50,DWSA7敲除大鼠△F×s为9354.15±770.91,与野生大鼠曲线下面积相比明显降低(***P<0.001);(ii)在HEK293T细胞系中共转DWSA7+TPRV1与单转TRPV1后,通过膜片钳记录capsaicin(1μM)诱发的TRPV1电流,capsaicin可诱导TRPV1单独转染HEK293T细胞产生平均电流为1501.22±252.24 p A,DWSA7和TRPV1共转染的HEK293T细胞由capsaicin诱导产生的平均电流为2957.64±826.05 p A,与TRPV1单转对照组相比变大(*P<0.05),且共转DWSA7+TPRV1细胞的TRPV1电流曲线下面积(137.72±30.94)与单转TPRV1细胞的电流曲线下面积(39.61±9.52)相比也明显增大(**P<0.01)。以上结果说明DWSA7本身可以增加TRPV1通道的功能,DWSA7敲除可降低DRG神经元中TRPV1的功能。(4)DWSA7与TRPV1作用机制:通过CO-IP的方法,证明DWSA7和TRPV1二者之间有直接的相互作用。结论:DWSA7敲除大鼠对热刺激敏感性下降;DWSA7敲除不影响DRG神经元中TRPV1通道的表达;DWSA7敲除降低DRG神经元中TRPV1的功能;DWSA7蛋白可能与TRPV1直接相互作用而影响TRPV1通道的功能。