1.研究背景 目前非霍奇金淋巴瘤发病率呈逐渐上升趋势。在美国，T细胞淋巴瘤发病率约占所有非霍奇金淋巴瘤发病率的15.20％。而在中国，T细胞淋巴瘤发病率偏高，约占25-35％。与B细胞淋巴瘤相比，多数T细胞淋巴瘤预后较差，目前尚无标准治疗，若按常规CHOP方案治疗效果欠佳，且容易复发，因此如何提高T细胞淋巴瘤治疗的有效率和总生存成为当前淋巴瘤治疗中的一个研究热点。 随着人们对信号转导系统及与之相关的分子靶点药物研究的不断深入，靶向治疗己成为一种极有发展前景的肿瘤治疗模式。mTOR对细胞正常生长增殖中起着极为重要的作用。许多肿瘤存在有编码mTOR信号通路相关蛋白的基因突变，这些蛋白的表达异常可引起mTOR通路过度激活。与正常细胞相比，肿瘤细胞由于存在P13K/AKT/mTOR途径失调，对mTOR抑制剂更为敏感。以mTOR为靶点可抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡和逆转肿瘤细胞对细胞毒性药物的抗药性。 RAD001是新型口服的mTOR抑制剂，具有更好的水溶性以及在有机溶剂和水溶液中有更好的稳定性。多项临床前研究表明，RAD001单药对多种肿瘤细胞具有抗肿瘤活性；Ⅰ/Ⅱ期临床试验结果提示RAD001单药不良反应轻，易为患者所接受。多项体内外实验结果均提示了RAD001有良好的临床应用前景。 关于靶向治疗如何与化疗药物联合或靶向药物彼此之间的联合也是靶向治疗的一个备受关注的问题。一些临床前研究和临床试验已初步显示由于各种药物不同的作用机制以及药物间的相互作用，通过改变药物的联合用药方式可能改变药物间原来的拮抗作用，转化为协同或相加作用。遗憾的是，到目前为止，RAD001治疗T细胞淋巴瘤的研究资料仍非常缺乏。因此，研究RAD001对T细胞淋巴瘤抗肿瘤作用以及与其它药物不同联合方式的抗增殖作用，有可能为T细胞淋巴瘤的治疗提供新选择。 2.研究方法 将RAD001单药以及其分别与化疗药物ADM、VP-16、VCR和靶向药物Velcade、Gleevec联合作用于人T淋巴瘤Hut-78、Jurkat细胞，用MTT法检测RAD001单药及联合用药对Hut-78、Jurkat细胞抗增殖作用；然后用流式细胞学(PI染色)检测RAD001单药对Hut-78、Jurkat细胞凋亡/周期阻滞的影响；最后提取实验组(用RAD001单药处理)和对照组(空白对照组和溶剂DMSO组)细胞总蛋白，通过Western Blotting分析目的蛋白p70s6k、p-p70s6k、cyclinD1、cyclinD3、cdk4在不同组间表达是否有差异。 3.实验结果 3.1 RAD001单药对人T淋巴瘤细胞株抗肿瘤作用RAD001单药作用于人T细胞淋巴瘤Hut-78、Jurkat细胞48小时后，测得IC50值分别为(5.57±0.08)μmol/L、(4.52±0.05)μmol/L，提示RAD001单药对Hut-78、Jurkat细胞均有抗增殖活性，呈浓度依赖性。 3.2 RAD001与化疗药物联合对人T淋巴瘤细胞抗肿瘤作用RAD001单药分别与化疗药物ADM、VP-16、VCR．以不同浓度梯度按一定比例混合共同作用于Hut-78、Jurkat细胞，结果显示：在一定浓度范围内，RAD001分别与ADM、VP-16联合作用指数CI值均＜1，提示有RAD001与ADM、VP-16均有协同作用；而RAD001和VCR联合作用指数CI值＞1，提示RAD001与VCR联合时有拮抗作用，而且在Jurkat细胞中表现更为明显。 3.3 RAD001与靶向药物联合作用对人T淋巴瘤细胞抗肿瘤作用RAD001单药分别与靶向药物Velcade、Gleevec以不同浓度梯度按一定比例混合共同作用于Hut-78、Jurkat细胞，结果显示：在一定浓度范围内，RAD001和Velcade联合作用CI值均＜1，提示有RAD001与Velcade有协同作用，随两药浓度的增加，协同作用愈为显著；而RAD001和Gleevec联合作用指数CI＞1，提示RAD001与Gleevec联合时有拮抗作用。 3.4研究RAD001对人T淋巴瘤细胞凋亡/周期阻滞的影响RAD001作用于Hut-78、Jurkat细胞24小时后并未见明显凋亡，延长RAD001作用时间至48小时，实验组细胞仍未见明显凋亡，实验组和空白对照组、DMSO组的细胞凋亡率均无明显差异(P＜0.05)。而当RAD001作用于实验组细胞24小时后，与对照组(空白对照组和DMSO对照组)相比，G1期细胞比例明显增多；延长RAD001作用时间至48小时后，G1期细胞的比例较24小时实验组也有明显提高，这种G1期阻滞现象在Jurkat细胞中表现得更为明显。提示了RAD001对人T细胞淋巴瘤的抗增殖作用可能不是在于诱导细胞凋亡，而是通过把肿瘤细胞阻滞于G1期，从而抑制细胞生长，而其周期阻滞作用呈时间依赖性。 3.5进一步探讨RAD001对人T淋巴瘤细胞抗增殖作用的分子机制 ①RAD001作用48小时后与对照组蛋白表达情况比较，发现Hut-78、Jurkat细胞实验组cyclinD1、cyclinD3、cdk4表达均明显减少或没有表达，提示RAD001对人T细胞淋巴瘤细胞G1期相关周期蛋白有明显抑制作用，从而是把肿瘤细胞阻滞在G1期。 ②当RAD001作用于Hut-78、Jurkat细胞48小时后，与对照组蛋白表达情况相比，发现p70s6k、p-p70s6k在实验组表达明显受到抑制，提示当RAD001作用于人T淋巴瘤细胞时，通过阻断靶点mTOR，使P13K/AKT/mTOR信号通路的下游受到抑制，影响肿瘤细胞的周期调节和代谢等，导致肿瘤细胞生长受到抑制，从而发挥其抗增殖作用。 3.6 RAD001联合ADM或Velcade不同用药顺序对Hut-78细胞抗增殖作用的影响 ①通过变换RAD001和ADM、RAD001和Velcade的用药顺序，结果提示先用RAD001后再用ADM或Velcade，两者存在拮抗作用，原因可能在于ADM及Velcade都是G2/M期阻滞的药物，会把肿瘤细胞阻滞在G2/M期，若先用RAD001会使Hut-78细胞阻滞在G1期，而再用ADM或Velcade就不能使肿瘤细胞进入G2/M期。 ②为了进一步探讨先用RAD001后用ADM或Velcade之间的拮抗作用，我们把RAD001先作用于Hut-78细胞，24h后更换培养基去除其中的RAD001，然后再加入ADM或Velcade作用24h，结果表明去除培养基中的RAD001后ADM或Velcade就可以使G1期的细胞进入G2期。 4.结论 1)RAD001单药对人T淋巴瘤Hut-78、Jurkat细胞均有良好抗增殖作用； 2)RAD001与化疗药物ADM、VP-16联合作用于人T淋巴瘤Hut-78、Jurkat细胞均提示有协同作用，而RAD001与VCR联合作用于Hut-78细胞和Jurkat细胞具有拮抗作用； 3)RAD001与靶向药物Velcade联合作用于人T淋巴瘤Hut-78、Jurkat细胞均提示有协同作用，而RAD001与Gleevec联合作用于Hut-78、Jurkat细胞具有拮抗作用； 4)RAD001对人T淋巴瘤Hut-78、Jurkat细胞的抗增殖作用可能是通过把肿瘤细胞阻滞于G1期，而未发现RAD001对Hut-78、Jurkat细胞有诱导作用； 5)RAD001对人T淋巴瘤Hut-78、Jurkat细胞抗增殖作用的分子机制可能是通过阻断mTOR靶蛋白下调了P13K/Akt/mTOR下游通路和抑制了G1期周期相关蛋白cycliD1、cyclinD3和cdk4等，从而抑制了肿瘤细胞生长。 6)RAD001和ADM或Velcade联用时，不同用药顺序对Hut-78细胞抗增殖活性不同。 ①先用RAD001后用ADM，在周期阻滞方面两者会产生拮抗作用，而当去除了培养基中的RAD001后，RAD001对ADM周期阻滞的拮抗作用消除。 ②先用RAD001后用Velcade，在周期阻滞方面两者会产生拮抗作用，而当去除了培养基中的RAD001后，RAD001对Velcade周期阻滞的拮抗作用消除。 ③目前RAD001在临床试验中的推荐用法是连续每天口服使用，提示临床上若将RAD001与ADM或Velcade联合使用时，可能应先将RAD001暂停服用，待体内将该药清除后(即间隔4至5个半衰期的时间)，然后再使用ADM或Velcade，这样可能可以避免两药在周期阻滞方面的拮抗作用，并起到协同抗肿瘤的功效。