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鸡球虫病是由鸡艾美尔球虫所引起的主要侵害鸡肠道的一种寄生虫疾病,该病严重制约着规模化养殖业的发展,给养禽业带来了严重的经济损失,目前,控制鸡球虫病的手段主要是通过药物的预防,但由于耐药性、药物残留、经济成本等一系列原因,促使我们必须寻找更加合理有效的预防手段。乳酸菌作为一种食品级微生物,近年来逐渐被开发成口服疫苗的载体。前期研究中我们在乳酸菌表面表达了球虫子孢子入侵相关蛋白3-1E,动物实验表明,表达3-1E蛋白的重组乳酸菌对雏鸡免疫后产生了抗球虫感染的免疫应答。本研究在此基础之上,对表面表达系统进行了改造,即:将树突细胞诱导肽（DC targeting peptides,DCpep）与球虫3-1E编码基因融合,期望可以借此增强机体肠道树突状细胞对目标抗原的识别和摄取,进而产生更强的特异性免疫应答。研究通过动物免疫实验检测了构建的重组乳酸菌激发机体的免疫应答水平,并对乳酸菌免疫后的抗球虫免疫保护效果进行了评估。1、构建融合表达DCpep与3-1E蛋白的重组乳酸菌。将合成的含有L.lactis NZ9000 U sp45信号肽与DCpep靶向肽的片段（SP-DCpep）克隆入乳酸菌表面表达质粒pTX8048-SP-3-1E-CWA中取代SP片段。将验证正确的阳性质粒电转化入L.lactis NZ9000与E.faecalis MDXEF-1（鸡源肠道共生粪肠球菌）中,筛选获得阳性重组菌L.lactis NZ9000/pTX8048-S P-DCpep-3-1E-CWA与E.faecalis MDXEF-1/pTX8048-SP-DCpep-3-1E-CWA,两种阳性菌分别使用终浓度为5 ng/mL的Nisin进行诱导,通过Western-blot验证目的蛋白的表达,结果表明目的蛋白在宿主菌L.lactis NZ9000与E.faecalis MDXEF-1中均成功表达,大小约为为53kDa。2、重组菌经口服免疫SPF雏鸡。重组菌用5 ng/mL的Nisin诱导培养3 h后4℃8000 rpm离心12 min,菌体沉淀用灭菌水清洗三次,再用一定量的PBS悬起,E.faecalis MDXEF-1重组菌调整菌落浓度至5×10100 CFU/mL;L.lactis NZ9000重组菌调整菌落浓度至1011CFU/mL。SPF雏鸡共300只分为8组,每组35只,各组鸡5-7、21-23、37-40日龄时进行免疫,每只鸡口服100μL重组乳酸菌,空白对照组与感染对照组口服100μL PBS。每次免疫后第14 d,每组取五只鸡心脏采血分离血清,制备各组鸡盲肠冲洗液,通过间接ELISA方法检测血清IgG与盲肠冲洗液IgA抗体水平;三免后第14 d各组鸡取外周血制备淋巴细胞悬液,CCK8试剂盒检测三免后外周血T淋巴细胞增殖情况,并采用流式细胞仪对外周血T淋巴细胞亚型变化情况进行检测;三免后取各组鸡脾脏,实时荧光定量PCR方法对三免后脾脏IL-2与IFN-γmRNA表达量进行检测。结果表明,随着免疫的进行,表达3-1E蛋白的重组菌免疫组血清IgG抗体与盲肠冲洗液IgA抗体水平呈上升趋势,且DCpep融合表达菌免疫组的抗体水平上升相对于非融合表达组更为明显（P<0.05）;三疫后,表达3-1E蛋白的四种重组菌外周血T淋巴细胞增殖能力,外周血CD4+与CD8+T细胞的数量,脾脏IL-2与IFN-γmRNA的相对表达量均极显著高于空菌组与PBS组,其中,DCpep融合表达组的上述相关指标均显著高于非融合表达组（P<0.05）。3、重组乳酸菌免疫后的抗球虫感染的保护效果评估。三次免疫后除PBS组外,各组鸡每只口服2×104个E.tenella孢子化卵囊,攻虫7 d后全部剖杀。通过对体重增重、盲肠病变计分、卵囊排出减少率、抗球虫指数等指标的检测来评估免疫保护效果。结果表明,DCpep融合表达组各项指标均优于非融合表达组,E.faecalis MDXEF-1/pTX8048-SP-DCpep-3-1E-CWA、E.faecalis MDXEF-1/pTX8048-SP-3-1E-CWA、L.lactis NZ9000/pTX8048-SP-DCpep-3-1E-CWA、L.lactis NZ9000/pTX8048-SP-3-1E-CWA、E.faecalis MDXEF-1、L.lactis NZ9000六组的平均增重依次为:106.75 g、99.03 g、111.28 g、106.61 g、54.81 g、50.43 g,盲肠平均病变计分依次为:1.6、2.4、1.4、1.8、3、3.6,卵囊排出减少率依次为:38.52%,、32.09%、41.75%、35.23%、11.38%、3.64%,抗球虫指数为:166.21、155.57、171.75、163.96、112.73、107.68。四种重组菌免疫组盲肠眼观病理变化与病理组织学变化相对于攻虫对照组均明显减轻。上述研究结果表明,DCpep与3-1E蛋白融合表达后能够提升机体的细胞与体液免疫应答水平,实验中的四种重组乳酸菌对球虫感染均具有一定的免疫保护效果,研究为基于乳酸菌的树突细胞靶向的口服疫苗奠定了基础。