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抗菌肽Thanatin是一个含有21个氨基酸残基的线性多肽,首次被发现存在于昆虫椿(Podisus maculiventris)中,与蛙(frog)皮肤抗菌肽brevinin家族有很高的序列同源性。其有一个位于C末端的二硫键桥环,属于阳离子抗菌肽,既抗真菌,又抗细菌,表现出极广的抗菌谱,具有广阔的应用价值。由于在组织内含量微少,所以很难从组织中获得大量的抗菌肽。通过化学合成的方法获得抗菌肽成本高,因此利用基因工程的方法生产抗菌肽成为近年来研究的热点。本研究首次构建了含家蚕核型多角体蛋白Polh与Thanatin融合基因的原核表达载体,进行原核表达,纯化后用盐酸羟胺切割后初步纯化获得具有抗菌活性的Thanatin蛋白;研究首次以昆虫杆状病毒体系中表达了椿(Podisus maculiventris)抗菌肽Thanatin。获得以下主要结果:1.根据大肠杆菌基因密码子偏爱性,对Thanatin进行基因优化,并用overlapextension PCR的方法扩增,得到Thanatin基因与家蚕核型多角体病毒多角体蛋白Polyhedrin基因融合基因,将融合基因克隆到表达载体pET28a(+)中,构建了表达载体pET-28a-Polyhedrin-Thanatin,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达。大肠杆菌表达产物经过SDS-PAGE电泳和Western blot检测,诱导表达的菌体中有与融合蛋白理论值(35kD)相符的目的条带,凝胶扫描分析目的融合蛋白以包涵体的形式表达,且诱导后6h融合蛋白的表达量最大,约占菌体总蛋白量的30%,表明Polyhedrin-Thanatin融合基因在E.coli BL21(DE3)宿主菌中获得成功表达。融合蛋白纯化后用盐酸羟胺切割后初步纯化,经过抑菌试验结果表明,表达的Thanatin蛋白具有一定的抑细菌活性。2.采取Bac–to-Bac表达系统将抗菌肽Thanatin基因在昆虫细胞中表达,将抗菌肽Thanatin基因克隆至杆状病毒转移载体pFastBacI,构建的重组质粒pFastBacI-Thanatin转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,发生体内重组,获得杆粒Bacmid-Thanatin。杆粒DNA在脂质体Lipofectin介导下侵染家蚕细胞(BmN),获得含Thanatin基因的重组杆状病毒,重组病毒感染Bm细胞后,表达目的蛋白。超声裂解细胞,抑菌试验结果显示,表达的Thanatin蛋白具有抑制大肠杆菌菌活性。为今后进一步的分离纯化Thanatin等实验研究提供依据。