微生物在自然界中扮演重要角色,对一切生物的存在均具有重要意义。在昆虫中也普遍存在着真菌、细菌、病毒等,目前对昆虫-微生物之间的相关性研究不断深入,从最初基于分离培养的方法从昆虫的各个部位分离到一定的真菌物种(约1%),随后伴随生物技术的迅猛发展,我们基于分子指纹图谱、克隆文库、下一代测序技术、单分子测序技术从昆虫体内检测到了大量的真菌物种,检测所得99%真菌物种是采用分离培养技术而言所不能获得的。由于高通量技术可以获得大量的序列及价格相对合理,因此众多科学家在采用该技术。伴随测序技术的不断发展,越来越多的昆虫完成了全基因组和转录组的测序工作,昆虫测序产生的所有序列在完成自身的信息分析后,还存在未匹配到宿主组装基因组的序列,即非宿主序列,这些非宿主序列的数量比较庞大,可以与宏基因组或宏转录组的数据相媲美,所占的比例约为17%-34%,若在以往的情况下则视为垃圾序列而被丢弃。在本实验中,我们应用这些非宿主序列研究宿主中存在的真菌信息则具有重要意义。在本实验中,我们以测序对叶榕传粉榕小蜂Ceratosolen solmsi雄虫基因组产生的所有非宿主序列,测序雌雄虫的幼虫、蛹、成虫的转录组产生的总序列中未匹配到榕小蜂组装基因组组的非宿主序列,研究榕小蜂中包含的真菌信息。应用基因组的非宿主序列研究宿主中存在的真菌信息：本实验首次基于宿主全基因组序列中非宿主的序列分析了宿主体内的真菌,这对于研究已知某种昆虫体内的真菌菌群具有重要意义。本文从NCBI数据库中下载了已公布的全部真菌全基因组(共773个)、两个真菌保守基因-ITS基因(ITS参考数据库,共118603条序列)和28S rRNA基因(下载自SLIVA中LSU参考数据库,共1981条序列)、已公布的所有榕树-榕小蜂体内的真菌序列(共313条序列),用Bowtie将非宿主序列与参考数据库进行比对分析,比对时参数的设置是：100%相似性、99%相似性、97%相似性、95%相似性。同时在ITS参考数据库中查找773个真菌基因组所对应的ITS序列,共查找到402个ITS序列,基于95%的相似性将非宿主序列与402个ITS序列进行比对分析。通过上述比对分析后,可知基因组的非宿主序列中存在大量的真菌信息,ITS可作为最适参考数据库、95%序列相似性作为最适参数可用于研究非宿主序列中存在的真菌信息。我们的结果包含两部分,第一部分是宿主中存在的真菌信息,第二部分是与已知榕小蜂体内的真菌信息进行比较。第一部分结果：匹配所得真菌序列所占的比例为0.21%,所对应的真菌分类是：10个门、10个亚门、32个纲、159个属。其中所得真菌序列数目最多的是基因组参考数据库,其次是ITS参考数据库；匹配上物种数最多的是ITS-CS、其次是G-CS；同时我们的结果包含所有已公布的榕小蜂真菌的信息。与402个真菌基因组所对应的ITS序列进行比对后的结果可以进一步确定非宿主序列可以用于研究宿主中存在的真菌信息。第二部分结果：与已公布的榕小蜂体内的真菌菌群进行比较后,对叶榕传粉榕小蜂雄虫的真菌多样性完全包含其他榕小蜂中存在的真菌,并且其多样性要远远高于已公布的结果。我们的结果中所特有的真菌即：Agaricomycetes,该真菌纲所包含的属及物种数在原始数据中为优势属和优势种。在FD1中Ascomycota和Basidiomycota为优势门,Saccharomycotina、Pezizomycotina、Agaricomycotina、Tremellomycetes为优势亚门,Saccharomycetes、Sordariomycetes、Agaricomycetes, Pezizomycetes和Exobasidiomycetes为优势纲,优势属有Debaryomyces、Saccharomycopsis、Galactomyces和Tricholoma。通过上述结果,可知非宿主序列可以用于研究宿主中存在的真菌信息,能系统、全面、方便快捷的揭示宿主中存在的真菌信息,使测序产生的总数据产生了更深层次的价值,为真菌多样性研究提供新思路和新方法,尤其对于研究个体较小、体内微生物信息不易获取的宿主更具优势性。应用转录组的非宿主序列研究宿主中存在的真菌信息：在本实验中我们首次用ITS参考数据库分析转录组的非宿主序列中存在的真菌信息,首次用转录组的非宿主序列揭示宿主不同发育阶段中真菌菌群的动态变化,同时采用三个软件Bowtie1、Bowtie2和Pathoscope2对非宿主序列所揭示的真菌信息进行详细分析。采用三个参考数据库：分别为已公布的真菌全基因组、mRNA数据,从BLAST上下载所有的ITS参考序列。应用Bowtie 1在97%相似性时将非宿主序列与参考数据库进行比对,用Bowtie 2将Bowtie1比对所得结果与参考数据库进行比对,随后用Pathoscope 2进行Bowtie 2结果的分析。比较分析所得结果,ITS参考数据库、97%序列相似性能够充分揭示宿主中存在的真菌信息。首先,选取最适参考数据库。比较分析雄成虫与真菌基因组、mRNA、ITS比对后所得结果,可知匹配上的真菌信息最丰富的是ITS参考数据库,而信息最少的是mRNA参考数据库。由此可知,选取ITS参考数据库用于研究非宿主转录组中存在的真菌信息时较为合适。随后比较分析：雄成虫基因组的非宿主序列(NHRG-CS)中包含的真菌信息与转录组的非宿主序列(NHRT-CS)中包含的真菌信息,可知二者既存在共有真菌,也存在各自特有真菌,其中NHRT-CS结果中2/3的真菌是二者共有的,NHRG-CS结果中特有的真菌要明显多于NHRT-CS结果,这一结果支持了选取ITS参考数据库进行分析的合理性。其次,选取最优参数。前人对真菌多样性研究采用的经典参数为97%相似性,在本实验中我们用97%相似性参数对所有样品中匹配所得真菌序列和属的数量绘制稀释曲线,结果表明蛹期和雌成虫基本检测到了所有真菌,幼虫期和雄成虫未能充分检测所存在的真菌信息,这一结果说明在97%相似性时基本上可以揭示宿主中存在的真菌信息。再次,真菌菌群的结构和动态变化。比较各发育阶段中存在的真菌菌群,可知幼虫期最丰富,其次是成虫期,最后是蛹期。我们用稀释曲线的up-95%和lower-95%结果分析宿主不同发育阶段中的真菌菌群,可知伴随宿主的生长发育,其体内的真菌菌群呈现动态变化。综上实验结果,可知用ITS参考数据库、97%相似性可研究转录组的非宿主序列中所包含的真菌信息,尤其对研究具有重要功能的真菌；非宿主序列所揭示的宿主中真菌菌群伴随宿主的生长发育而呈现动态变化。通过该研究,将测序宿主基因组和转录组产生的总数据体现更深层次的价值,为真菌多样性的研究提供新思路和新方法,也为我们深入了解真菌-榕小蜂-榕果之间的互利共生提供储备。