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研究目的近年来随着肿瘤发病率的逐年增加,恶性肿瘤已经成为严重威胁人类生存的慢性病之一。肿瘤的治疗方法主要有手术治疗、化学药物治疗、放射治疗、及肿瘤生物治疗等。因近年来肿瘤患者对化学治疗出现耐药现象逐年增加,使肿瘤患者对现有的化学药物治疗受到限制,开发新的化学治疗药物迫在眉睫。细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinases, CDKs)的激活与失活维持着细胞周期各时相有序进行。CDK2磷酸化Rb是G1过渡到S期的关键步骤。抑制CDK2可以抑制肿瘤细胞的增生,为一个很好的抗肿瘤药物靶点。计算机辅助药物设计是一门使用计算机模拟分子作用,通过综合运用生物信息学工具,从而达到选取、发现候选新药目的。利用计算机蛋白-配体对接软件(idock)可以预测一个小分子非共价地结合到靶蛋白时,其最佳构象和亲和强度,通过其亲和强度的打分高低可以筛选到目的蛋白抑制剂。本实验利用蛋白-配体对接软件从FDA注册过的药物数据库筛选靶蛋白CDK2候选抑制药物,可以大大节省设计新药物的成本和时间。筛选到的靶蛋白CDK2候选抑制药物并被随后的体内体外实验室验证其生物有效性。本实验针对大肠癌、肝癌细胞对筛选出来的CDK2候选抑制剂进行实验室体内、外验证其对大肠癌、肝癌的治疗作用,寻找治疗大肠癌、肝癌的新型CDK2抑制剂。研究方法：(1) Redocking验证idock软件的准确性、有效性。(2)利用蛋白-配体对接软件(idock)找到CDK2靶蛋白的候选抑制剂。(3)通过MTT对初筛出来的候选药物进行肿瘤细胞抑制率的检测,从而找到目的药物。(4)对目的药物进行细胞周期实验验证其导致细胞周期阻滞的作用。(5)通过流式细胞仪对目的药物进行细胞凋亡实验验证其对肿瘤细胞的凋亡作用。(6)通过Western Blot实验检测目的药物对细胞周期信号通路的相关蛋白CDK2、cyclinD1、cyclinB1、cyclinE、Rb、pho-CDk2、pho-Rb的表达的影响。(7)检测目的药物对裸鼠移植瘤模型的治疗作用,观察其抗肿瘤效果。(8)蛋白-配体对接idock软件结构分析在分子水平说明目的药物抑制CDK2的作用机理。研究结果：(1) Redocking结果显示idock软件相对同类的软件的准确性、有效性提高了7%,速度提高了8.69-37.51倍。(2)通过蛋白-配体对接软件(idock)找到且购买到CDK2靶蛋白的候选抑制剂9个,并被随后的体内外实验验证其生物有效性。(3)通过MTT对初筛出来的候选药物进行肿瘤细胞抑制率的检测,从而找到对大肠癌细胞系DLD1及LOVO呈现时间及浓度梯度依赖性抑制效果最好的药物Adapalene (IC50:4.43μM for DLD1,7.135μM for LOVO)。同时找到对肝癌细胞系HepG2及Huh7呈现时间及浓度依赖性抑制效果最好的药物Fluspirilene(IC50:4.017μM for HepG2 and 3.468μM for Huh7)。(4)用Adapalene对大肠癌细胞系DLD1及LOVO进行细胞周期实验,结果显示Adapalene 30/10μM浓度呈现时间及浓度梯度依赖性G1期细胞阻滞增高趋势。Fluspirilene 30/10μM浓度对肝癌细胞系HepG2及Huh7呈现时间及浓度梯度依赖性G1期细胞阻滞增高趋势。(5) Adapalene 30/10μM浓度对大肠癌细胞系DLD1及LOVO干扰后进行细胞凋亡检测,结果显示呈现时间及浓度梯度依赖性凋亡细胞数增高趋势。Fluspirilene 30/10μM浓度干扰肝癌细胞系HepG2及Huh7呈现时间及浓度梯度依赖性凋亡细胞数增高趋势。(6)Adapalene药物干扰大肠癌细胞系DLD1及LOVO后.Western Blot检测CDK2、 cyclinE、Rb、pho-CDk2、pho-Rb蛋白随着药物的浓度增加而呈现表达下降的趋势,cyclinD1、cyclinB1蛋白的表达没有改变。Fluspirilene干扰肝癌细胞系HepG2及Huh7后Western Blot检测CDK2、cyclinE、Rb、pho-CDk2、pho-Rb蛋白随着药物的浓度增加而呈现表达下降的趋势,cyclinD1、cylinB1蛋白的表达没有改变。(7) Adapalene对DLD1皮下成瘤BALB/C裸鼠移植瘤模型进行药物治疗后,20mg/kg呈现明显的抗肿瘤的效果。Fluspirilene对Huh7皮下成瘤BALB/C裸鼠移植瘤模型进行药物治疗后,15mg/kg呈现明显的抗肿瘤的效果。(8)利用分子对接及分子动力研究表明Adapalene主要通过疏水键Phe82、Ile10、 Leu134、Lys33、His84与CDK2竞争ATP口袋区结合位点；Fluspirilene主要通过疏水键Phe82、Ile10、Leu134、His84与CDK2竞争ATP口袋区结合位点。结论：本实验利用了计算机蛋白-配体对接idock软件筛查CDK2靶蛋白抑制剂候选药物及进一步体内体外实验室验证其生物有效性。我们找到了抗大扇癌的药物Adapalene及抗肝癌药物Fluspirilene。Adapalene通过疏水键Phe82、Ile10、 Leu134、Lys33、His84与CDK2竞争ATP口袋区结合位点,从而抑制了CDK2的活性；Fluspirilene通过疏水键Phe82、Ile10、Leu134、His84与CDK2竞争ATP口袋区结合位点,从而抑制了CDK2的活性。通过抑制CDK2/cyclinE及Rb细胞周期通路从而使细胞大量的阻滞在G1期,并进一步导致细胞凋亡,延缓肿瘤细胞的生长。Adapalene及Fluspirilene表现出了良好口服活性剂和较低的毒性,可以成为潜在的抗大肠癌及肝癌的很好的CDK2抑制剂靶向药物。