生命的起源与演化问题在自然科学领域一直备受关注,古生物学家、进化生物学家依据发现的动植物化石或亚化石遗体或遗迹,来探寻它们的演化与灭绝的原因。但是,由于化石记录的不完整,建立在比较解剖学和形态分类学基础上的传统化石分析方法在研究中越来越难以解决生物演化方面的问题。通过现代分子生物学技术对古生物遗体或遗迹中古DNA的研究,为揭示古生物演化提供了有力的分子生物学证据,同时在研究对象和研究方法方面也拓宽了传统古生物学研究的领域。大熊猫是我国特有的珍稀濒危物种,地质历史时期中大熊猫在我国分布广泛,更新世中晚期大熊猫的分布达到全盛期,广泛分布于我国长江流域、珠江流域以及华北部分地区,最北界达40°N(周口店第一化石点),向南则延伸至越南、老挝、缅甸部分地区,向东抵达东南沿海地区,第四纪末次冰期大熊猫的分布范围也开始缩小。目前由于气候的变化和人类活动的影响,大熊猫分布目前仅限于陕西西南的秦岭南麓,四川盆地西北缘的岷山和邛莱山、西缘的大、小相岭及凉山。大熊猫的分类问题一直以来都是人们争论的热点,80年代以前其争论形成三派学说——熊科、浣熊科、大熊猫科(独立一科)。Mivart通过研究大熊猫的颅骨结构、四肢骨、牙齿、足型、肾、毛的触感、内脏以及一些化石,还有对进化有重要意义的第四上前臼齿,凭借大熊猫与浣熊类动物在颅骨结构、牙齿、内脏等方面具有的相似性,尤其是裂齿(P4)的齿冠冠型,他认为大熊猫应该属于浣熊科。1964年Davis发表了《大熊猫形态学与进化机理研究》的专著,他根据大熊猫50个器官系统比较研究的结果,断言“大熊猫每一个形态特征都表明它们仅仅是一种高度特化的熊,故可把它放在熊科,或对它的差异给予足够的承认,也可独立一科”。从这开始对大熊猫的分类地位逐渐形成两派——熊科、大熊猫科。林峰等采用PCR和Southern杂交等方法对大熊猫、小熊猫、马来熊、浣熊等共有的1条113kb的RAPD产物片段进行初步分析,发现马来熊产物则无相应的杂交带,认为这种结果暗示了大熊猫与熊科马来熊的亲缘关系要近于小熊猫和浣熊,主张将大熊猫划为熊科。用线粒体Cyt b、12S rRNA基因全序列和全基因组构建的系统发育树中可看出,大熊猫与熊类均在同一分枝上。对于分子生物学上本认为支持归属为熊科的证据,张亚平等重新解读为大熊猫与熊类在DNA序列上的相似性并不能作为大熊猫应归入熊科的有力证据,而且如果将细胞色素b的部分序列翻译成氨基酸序列,结果显示大熊猫与小熊猫更接近,因此正如黑猩猩与人类DNA序列有98%的相似性却不能归入人科一样,大熊猫也应该单独成为一科。近年来,随着大熊猫祖先化石的不断发现,学者们得出在中新世晚期大熊猫类与熊的祖先就已经出现平行发展,相互间有亲缘关系,但形态特征与熊科物种存在一定的差异,主张将大熊猫单独分为一科即大熊猫科。早期的研究认为,大熊猫的遗传多样性下降得较为明显。潘文石通过分析秦岭大熊猫种群,研究其遗传压力,得出该种群每代将以0.5456%近交率丧失遗传多样性。李杨文等、宿兵等用蛋白质电泳技术,分别对不同地区大熊猫进行血液同工酶及血浆蛋白比较研究,得出大熊猫种群的物种多样性贫乏的结论。张亚平等测定大熊猫线粒体tRNA基因和D环区序列,在21个实验样品中共检测出9种单倍型,分析得出大熊猫的遗传分化程度很低。方盛国等利用DNA指纹技术研究大熊猫种群的遗传多样性,认为5大山系的群体遗传多样性严重贫乏,山系之间存在明显的遗传分化。近期的研究表明,现生大熊猫的遗传多样性仍然保持中等或者更高的水平。Lu等研究岷山、邛崃及秦岭大熊猫种群的线粒体DNA控制区基因序列,从36个大熊猫个体中检测出17种单倍型,这些单倍型与大熊猫的地理分布并没有明显的相关性,通过限制性内切酶和微卫星序列探针进行分析,认为大熊猫的遗传多样性处于中等水平。Zhang等利用线粒体控制区序列和10个微卫星位点,分析了5个山系大熊猫种群的遗传多样性,通过与其他熊类进行比较,得出现存的大熊猫种群有高水平的控制区及微卫星位点多样性,大熊猫并没有处于进化的尽头。Li等通过大熊猫全基因组的测序,发现大熊猫种群仍然存在较高的遗传多态性。Hu等通过研究线粒体控制区序列,探讨了凉山地区大熊猫种群的遗传多样性,得出该地区的大熊猫遗传多样性处于中等水平。本研究采用硅粒-GuSCN法对采集于云南腾冲、广西田东、湖南桑植和云南镇雄的5个大熊猫样品(编号分别为05001,97001,GXPB,HNSZ,14162)中的古DNA进行提取,通过多重PCR方法进行扩增。最终GXPB,HNSZ,14162这3个样品未获得可靠的古DNA序列,采自云南腾冲的97001和05001的两个样品扩增获得了古DNA序列。用分子生物学方法研究了97001和05001样品线粒体中的Cyt b.12s rRNA、16s rRNA、ND1和D-Loop基因,结合GenBank中的同源序列,构建了熊科物种与大熊猫的系统发育树,利用D-loop的序列探讨了大熊猫的遗传多样性。主要得到以下几点结论：1.获得距今8740±45年的97001样品和距今5025±35年的05001样品中的古DNA。97001获得的线粒体DNA序列长度为5025bp,05001获得的DNA序列长度为5142bp。证明了硅粒-GuSCN-蛋白酶K法提取和多重PCR扩增等方法用于华南地区近万年样品古DNA实验是可行的,也说明了在高温潮湿的华南地区保存的近万年的化石样品中能够得到古DNA。2.经14对引物扩增得到Cyt b基因1140bp全序列。两条序列的碱基A、T、G、C平均含量分别为：29.3%,31.3%,14.2%,25.2%,其中A+T的含量为60.7%,G+C的含量为39.3%。通过分析大熊猫、棕熊、北极熊、太阳熊、懒熊、亚洲黑熊、美洲黑熊、眼镜熊、小熊猫和浣熊序列,得出Cytb序列的转换/颠换为4.2,进行饱和度分析后,得出序列的碱基的转换和颠换没有达到饱和。计算了两两序列间的遗传距离,得出大熊猫和熊科物种的遗传距离最小,与小熊猫和浣熊的遗传距离较大。经15对引物扩增得到12s rRNA基因966bp全序列。两个序列碱基的平均含量为：A,35.4%；T,24.6%；G,18.4%；C,21.6%。其中A+T含量为60.0%高于C+G含量40%。分析了大熊猫与现生的7种熊科动物、大熊猫、小熊猫及浣熊的碱基序列差异,转换/颠换为3.6,进行饱和度分析后,得出序列没有达到饱和。计算了两两序列间的遗传距离,得出大熊猫和熊科物种的序列差异和遗传距离最小。经13对引物扩增得到D-Loop基因部分序列(932bp),其中683bp为连续片段,碱基A、T、G、C平均含量分别为：28.8%,30.2%,15.7%,25.3%,A+T平均含量(59.1%)显著高于G+C的平均含量(40.9%)。分析了序列间的差异,碱基转换/颠换为0.9,饱和度分析显示,得出序列即将达到饱和,计算了两两序列间的遗传距离,结果显示大熊猫和熊科物种的平均遗传距离要小于与小熊猫。经15对引物扩增,97001得到16s rRNA基因部分序列(1064bp),05001得到16s rRNA基因部分序列(1181bp),从序列差异和遗传距离结果来看,转换/颠换为3.0,大熊猫与熊科动物的差异较小,遗传距离较近。经10对引物扩增得到ND1基因序列的长为923bp,其中830bp为连续片段,碱基A+T含量(61.5%)明显高于G+C含量(38.5%)。将其与同源序列进行比对分析,显示碱基转换/颠换为4.4,进行饱和度分析后,得出序列没有达到饱和。计算了两两序列间的遗传距离,得出大熊猫和熊科中眼镜熊的遗传距离最小。5个基因得出的序列差异和遗传距离有差别,可能是跟基因的保守程度有关。3.得到的古DNA序列是可靠的。古DNA提取,PCR混合液的配制以及克隆均在独立的实验室进行。在实验过程中,严格按照古DNA的实验要求进行操作,从提取、PCR扩增和分子克隆都设立了相应的对照实验以监控污染情况。对每一个样品的每一对引物基本上都经过了两次以上的扩增、克隆和测序以确定序列的原生性。对所得的序列进行GenBank的Blast搜索,得出序列与现生大熊猫的相似性最高。本研究中古DNA序列进行了多次重复性实验的验证,在本实验室由不同的研究者进行操作,并在澳大利亚阿德莱德大学古DNA研究中心进行了重复性实验,所得到的序列与在中国地质大学(武汉)实验所得的序列是一致的。综上所述,本研究所得的古DNA数据是可靠的。4.基于Cyt b基因全序列、12s rRNA基因全序列、16s rRNA基因部分、ND1部分序列和D-Loop基因部分序列用MEGA软件与同源序列进行比对,同时也选择了Cyt b+12s rRNA、Cyt b+D-loop、Cyt b+12s rRNA+D-Loop、Cyt b+12s rRNA+16s rRNA+ND1和Cytb+12s rRNA+16s rRNA+ND1+D-loop组合序列分别用邻位法(NJ)、最大简约法(MP)和最小进化法(ME)构建系统发育树,其中由Cyt b、16s rRNA、ND1和Cyt b+12s rRNA+16s rRNA+ND1序列构建的系统发育树拓扑结构是完全一致的,只是分支上的自展支持率的数值略有差别。由12s rRNA、D-Loop单序列和组合序列所构建的系统发育树在拓扑结构上不完全一致,但有相同之处,棕熊、北极熊、大熊猫、小熊猫及浣熊所处的位置在所构建的所有系统发育树上都是一样的,只是自展值略有差别。从所有构树的结果来看,D-loop基因序列参与构建的系统树在拓扑结构上与其它序列所构建的系统树有较为明显的差别,因此,本研究认为D-loop序列不适合用来构建系统分析探讨大熊猫的系统演化关系。利用物种的双个体的同源序列构建系统发育树,结果表明,物种单个体用来构建系统发育树是可行的,排除了系统进化树上的物种单个体效应。在系统发育分析中,加入本研究所得的古DNA序列,提高了系统发育树的精度,使得熊科物种、大熊猫、小熊猫和浣熊之间的亲缘关系得到了进一步明确：浣熊最先分离,其次是小熊猫,大熊猫较晚分离,大熊猫和熊科物种有较近的亲缘关系。5.用PAML软件的mcmctree程序基于Cyt b+12s rRNA+16s rRNA+ND1序列的组合数据构建的系统发育树,计算了物种间的分歧时间。小熊猫和大熊猫的分歧时间为17.12Ma,大熊猫和熊科其他物种的分歧时间为12.68Ma。据化石记录得出的大熊猫和熊科物种的分歧时间为12Ma,与本研究算出的分歧时间相近。通过对构建的系统发育树和物种分歧时间进行分析,本研究认为大熊猫很早就与熊科动物中分化出来,进行了独立的进化与演化,支持把大熊猫划为独立的一科即大熊猫科。6.基于所获得的两个古代大熊猫655bp线粒体D-loop序列,与从GenBank获得的40个现生大熊猫的同源序列,用MEGA软件对42个序列进行Clustal W比对后,将数据导入DnaSP5.0进行分析,结果表明,42个序列组成上都不一样,分别属于42个大熊猫单倍型。根据655bp同源序列的碱基变化以及单倍型在不同地区的分布情况,利用Network4610软件构建了42种大熊猫单倍型的简约网络图,通过DNASTAR软件构建了42种大熊猫单倍型的系统发育树。结果表明,大熊猫的单倍型的多样性还是非常丰富的,并且在不同地区存在多种共享基因单倍型,说明在不同地区分布的大熊猫之间存在广泛的基因交流,使这个物种在遗传上始终保持着多样性。在5000年以前云南所分布的大熊猫古老的单倍型已经通过基因交流得以扩散到秦岭,邛崃山,凉山和岷山等地区。利用BEAST1.7.4程序进行Bayesian skyline plot(BSP)评估了过去8700多年来大熊猫的有效群体变化,结果显示,大熊猫的种群数量是在距今5000多年前开始下降的,现在其种群数量趋于稳定,现阶段可以通过加大建造各大熊猫栖息地之间的“绿色走廊”,增加种群之间的互相沟通,提高种群杂合率,来丰富其遗传多样性。