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目的:日常生活中塑化剂应用所致生殖损伤等问题已引起社会广泛关注,本课题旨在观察常见塑化剂三邻甲苯磷酸酯(tri-ortho-cresyl phosphate,TOCP)暴露对雌性小鼠卵巢功能损伤及原始卵泡发育的影响,并检测Hippo信号通路在介导TOCP对卵巢功能损伤中的作用及调控,为进一步了解塑化剂的雌性生殖毒性增添新资料,为女性不孕症的防治、妇女绝经期提前及卵巢功能早衰的治疗提供新思路。方法:1.建立小鼠TOCP染毒模型,分为对照组(0 mg/kg/d)、低剂量组(100mg/kg/d)、中剂量组(200 mg/kg/d)、高剂量组(400 mg/kg/d),每组10只小鼠,按照上述浓度连续灌胃1个月。检测卵巢指数及血E2和P0变化;HE染色观察卵巢形态学变化并进行卵泡计数;TUNEL荧光染色检测卵泡凋亡情况;Western Blotting检测促凋亡因子BAX和抑凋亡BCL-2的表达变化;Western Blotting同步检测Hippo信号分子MST1、LATS2、YAP1、P-MST1、P-YAP1的表达变化。2.建立原始卵泡TOCP体外培养模型,分为0 mM、0.125 mM、0.25 mM、0.5 mM、1 mM剂量组,利用HE染色、卵泡计数和TUNEL染色等方法观察TOCP暴露对原始卵泡发育的影响;Western Blotting同步检测Hippo信号分子MST1、LATS2、YAP1、P-MST1、P-YAP1的表达变化。3.构建Hippo信号通路下游效应分子YAP1慢病毒过表达载体,通过卵巢显微注射方式,建立TOCP(200 mg/kg)-YAP1小鼠模型。检测卵巢指数的变化,HE染色观察卵巢形态学变化并进行卵泡计数;Western Blotting检测促凋亡因子BAX和抑凋亡BCL-2的表达变化,并通过整体交配方法观察其生仔率。4.建立原始卵泡TOCP(0.5 mM)-YAP1体外培养模型。HE染色观察小鼠卵巢的形态学变化并进行卵泡计数;免疫荧光染色检测GFP的表达变化。结果:1.卵巢指数结果显示:与对照组相比,100、200和400 mg/kg TOCP处理组小鼠卵巢指数呈剂量依赖性降低(p<0.05,p<0.01)。激素检测结果显示:与对照组相比,100、200和400 mg/kg TOCP处理组小鼠血E2水平均升高(p<0.05);血P0水平降低(p<0.05,p<0.01)。HE染色结果显示:在100 mg/kg TOCP浓度组中,卵巢结构出现轻微的变形以及卵泡数目减少;在200和400 mg/kg TOCP浓度组中,卵巢结构明显被破坏,各级卵泡形态显著异常,且卵泡数目急剧下降。卵泡计数结果显示:与对照组相比,100、200和400 mg/kg TOCP处理组小鼠原始卵泡、窦前卵泡及成熟卵泡数目显著减少,闭锁卵泡则显著增加。TUNEL荧光染色结果显示:随着TOCP剂量增加,凋亡卵泡数目呈剂量依赖式增加。通过统计凋亡率发现,与对照组比较,100、200和400 mg/kg TOCP处理组小鼠卵巢卵泡凋亡率呈剂量依赖式升高(p<0.01,p<0.001)。Western Blotting结果显示:与对照组相比,100、200和400 mg/kg TOCP处理组BAX/BCL-2的值均显著增高(p<0.001)。Western Blotting同步检测结果显示:与对照组相比,100、200和400 mg/kg TOCP处理组小鼠卵巢MST1和LATS2蛋白表达量均升高(p<0.05,p<0.01),而YAP1蛋白表达量显著降低(p<0.05,p<0.01),P-MST1/MST1比值降低(p<0.05),但P-YAP1/YAP1比值显著升高(p<0.01)。2.HE染色结果显示:在Blank组和0 mM浓度组中,卵巢组织结构完整,卵泡形态正常,部分原始卵泡生长发育变为初级卵泡;在0.125 mM浓度组中,卵巢结构出现轻微的变形,卵泡数目显著降低;在0.25 mM和0.5 mM浓度组中,卵巢结构明显被破坏,卵泡形态显著异常,闭锁卵泡增多且总卵泡数目急剧下降;在1 mM浓度组中,卵巢结构严重破坏,几乎没有发现卵泡存在。卵泡计数结果显示:与对照组相比,0.125 mM、0.25 mM、0.5 mM和1 mM处理组乳鼠卵巢中原始卵泡、初级卵泡及卵泡总数显著减少。TUNEL荧光染色结果显示:随着TOCP剂量增大,卵泡细胞凋亡越明显,细胞凋亡数目越多。免疫组织化学染色结果显示:对照组乳鼠卵巢中正常或正在增殖的卵泡细胞几乎没有发生凋亡,阳性细胞数量很少;0.125 mM、0.25 mM、0.5 mM处理组乳鼠卵巢存在较多的凋亡细胞,被染成棕色,而且随着剂量增大,卵泡细胞凋亡越明显,细胞凋亡数目越多。Western Blotting结果显示:与对照组相比,0.125 mM、0.25 mM、0.5 mM、1 mM处理组小鼠卵巢MST1未出现显著差异,LATS2表达量升高,(p<0.05,p<0.01,p<0.001),而YAP1表达量显著降低(p<0.05,p<0.01),P-MST1/MST1比值降低(p<0.05,p<0.01),但P-YAP1/YAP1比值显著升高(p<0.05,p<0.01)。3.卵巢指数结果显示:与对照组相比,Vector组无显著差异,Vector-YAP1组小鼠卵巢指数明显升高(p<0.01)。HE染色和卵泡计数结果显示:与对照组相比,Vector-YAP1组小鼠卵巢原始卵泡数显著下降,窦前卵泡和成熟卵泡数显著升高,闭锁卵泡数显著下降(p<0.01,p<0.001)。Western Blotting结果显示:与对照组相比,Vector组BAX/BCL-2比值无明显变化,Vector-YAP1组BAX/BCL-2比值显著降低(p<0.001)。整体交配结果显示:Vector-YAP1组子代出生率增加(p<0.05)。4.免疫荧光结果显示:YAP1过表达慢病毒载体和阴性对照慢病毒载体均可有效转染乳鼠的卵巢组织。HE和卵泡计数结果显示:与0.5 mM TOCP组相比,0.5 mM TOCP+Vector-YAP1组中原始卵泡数目减少,正在发育的卵泡数目显著增多。结论:1.TOCP暴露影响卵巢功能致雌性生殖损伤。2.Hippo信号通路表达异常是TOCP所致雌性生殖损伤的病理学机制之一。