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目的:纯化原核表达的刚地弓形虫棒状体17蛋白(Rhoptry protein17,ROP17),制备其多克隆抗体,并进行效价和免疫源性鉴定。构建二氢叶酸还原酶-胸苷酸合成酶-TgROP17真核表达载体(pIRES/TgDHFR-TS-TgROP17),转染人胚肾细胞(HEK 293T)中,血清饥饿后对ROP17参与自噬调控的作用及其机制进行初步研究。方法:第一部分:将重组质粒pGEX-6P-1-ROP17转化至大肠埃希菌BL21(DE3),并用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。通过亲和层析法纯化重组蛋白(GST-ROP17),纯化蛋白免疫SD大鼠,制备多克隆抗体,并用蛋白质印迹(Western blotting)对其进行免疫源性鉴定。第二部分:以弓形虫速殖子总RNA为模板,构建重组载体pIRES/TgDHFR-TS和重组质粒pIRES/TgDHFR-TS-TgROP17。经菌液PCR、双酶切和测序鉴定后,将重组载体转染人胚肾细胞(HEK 293T),RT-PCR和Western blotting检测基因和蛋白的表达。第三部分:通过免疫组化观察感染弓形虫BALB/c小鼠的脑组织中自噬蛋白LC3的表达情况。将第二部分构建好的重组质粒分别转染人胚肾细胞(HEK293T),转染重组载体pIRES/TgDHFR-TS组作为对照组;转染重组质粒pIRES/TgDHFR-TS-Tg ROP17组作为实验组。对转染细胞血清饥饿诱导0、6、12h后提取蛋白,通过Western blotting检测自噬标志蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1和P62。通过单丹(磺)酰戊二胺(monodansylcadaverine,MDC)染色、GFP-LC3融合蛋白表达以及透射电镜来检测自噬小体的形成。通过Western blotting检测各组通路蛋白JNK、p-JNK、Bcl-2、p-Bcl-2的表达。结果:第一部分:将纯化后的重组蛋白免疫SD大鼠,收集血清并获得多克隆抗体,Western blotting结果显示在69kDa处有符合条件大小条带,并且该蛋白分布于速殖子的超声上清中。同时Western blotting结果显示弓形虫感染的BALB/c小鼠肝、肾、脾组织中均有ROP17蛋白的表达。第二部分:菌落PCR、双酶切及测序结果显示重组载体pIRES/TgDHFR-TS构建成功;转染293T细胞后RT-PCR和Western blotting结果显示,在转染pIRES/TgDHFR-TS的细胞中有TgDHFR-TS的表达,基因大小为1809 bp,蛋白质相对分子质量(Mr)约为68kDa。菌液PCR、双酶切和测序结果显示重组载体pIRES/TgDHFR-TS-TgROP17构建成功,转染293T细胞后RT-PCR和Western blotting结果显示,在转染pIRES/TgDHFR-TS-TgROP17的细胞中有Tg ROP17的表达,基因大小为1860 bp,蛋白质相对分子质量(Mr)约为70kDa,而转染pIRES/TgDHFR-TS质粒组未见相应分子量基因和蛋白的表达。第三部分:免疫组化结果显示感染弓形虫的BALB/c小鼠脑组织中LC3蛋白表达量比正常BALB/c小鼠明显增加。在进行血清饥饿诱导后,Western blotting检测到随着血清饥饿时间的延长,LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化、Beclin-1蛋白逐渐增加、P62蛋白逐渐减少,与组内前一个时间点比较差异有统计学意义(P<0.05),且实验组与对照组相同的时间点相比较差异也有统计学意义(P<0.05);MDC染色、GFP-LC3融合蛋白表达以及透射电镜显示随着血清饥饿时间的延长,自噬小体逐渐增多,与对照组相同时间点比较差异有统计学意义(P<0.05),同一组内0、6、12 h组间差异有统计学意义(P<0.05)。同时Western blotting检测到随着血清饥饿时间的延长,JNK与p-JNK蛋白无变化,而Bcl-2蛋白逐渐减少、p-Bcl-2蛋白逐渐增加,与对照组相同时间点比较差异有统计学意义(P<0.05),同一组内0、6、12 h组间差异有统计学意义(P<0.05)结论:1.成功制备抗弓形虫ROP17大鼠多克隆抗体。2.成功构建重组载体pIRES/TgDHFR-TS和重组质粒pIRES/TgDHFR-TS-Tg ROP17,并且在293T细胞中成功表达。3.弓形虫棒状体蛋白17(ROP17)可能通过ROP17-Bcl-2/Beclin1信号通路促进血清饥饿诱导的细胞自噬。