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目的:研究通管丸大鼠含药血清对脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞炎症模型中PPAR-γ、TRAF6基因表达的影响,探索通管丸治疗输卵管炎性阻塞性不孕的作用机制,为通管丸的临床应用及研究提供实验依据。方法:1.含药血清的制备:将10只SPF级Wistar雌性大鼠,随机分为实验组和对照组,每组各5只。实验组按前期实验高剂量组给药,对照组予相应剂量的生理盐水,连续灌胃3天,每天灌胃2次,末次灌胃1小时后,经腹主动脉采血,灭活,除菌,分装,于-20℃的环境下保存备用。2.RAW264.7细胞培养:将小鼠RAW264.7细胞接种在含10%DMEM+10%FBS+1%青链霉素溶液培养基中,置于37℃,5%CO2的培养箱中进行培养,待其状态稳定,取对数期细胞用于后续实验。3.RAW264.7细胞增殖率检测:将呈对数生长的RAW264.7细胞随机分为9个组:(1)正常对照组(10%FBS)、(2)无药血清组(5%)、(3)无药血清组(10%)、(4)无药血清组(20%)、(5)无药血清组(40%)、(6)含药血清组(5%)、(7)含药血清组(10%)、(8)含药血清组(20%)、(9)含药血清组(40%),用CCK-8法检测RAW264.7细胞的增殖率。4.LPS诱导RAW264.7细胞炎症模型建立:选呈对数生长的RAW264.7细胞,设空白对照组、LPS诱导组,诱导组中加入浓度为100ng/ml LPS培养,对照组加含相应体积PBS的DMEM培养基,37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养24h后,收集细胞,用ELISA试剂盒检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)炎症因子的含量,以确定造模成功。5.Real-time PCR法检测RAW264.7细胞中PPAR-γ、TRAF6基因的表达:用正常RAW264.7细胞设置空白对照组A组,并将造模成功后的RAW264.7细胞随机分为B、C、D、E组,A组(空白对照组):正常RAW264.7细胞+胎牛血清10%;B组(无药血清组):造模成功后的RAW264.7细胞+无药血清(10%);C组(PPAR-γ激动剂组):造模成功后的RAW264.7细胞+20umol/L吡格列酮;D组(NF-ΚB阻断剂组):造模成功后的RAW264.7细胞+20umol/L NF-ΚB阻断剂(SN50);E组(通管丸含药血清组):造模成功后的RAW264.7细胞+通管丸含药血清(10%)。每组设置6个复孔,用Real-time PCR法检测RAW264.7细胞中PPAR-γ、TRAF6基因的表达。结果:1.小鼠RAW264.7细胞的形态学观察培养后生长良好的RAW264.7细胞,倒置显微镜下形态正常,似球形,少部分细胞变形,伸出小角。2.CCK-8法检测通管丸含药血清对RAW264.7细胞增殖率的影响通管丸含药血清浓度在10%时,RAW264.7细胞增殖率最高,倒置显微镜观察,可见细胞形态完整,似球形,表明细胞未受损伤。3.LPS作用后RAW264.7细胞形态学观察LPS(100ng/ml)诱导24h,显微镜下观察细胞形态,见细胞明显发生变化,多伸出伪足,提示造模成功。4.LPS诱导RAW264.7细胞炎症模型中TNF-α,IL-1β的含量5.LPS(100ng/ml)作用于RAW264.7细胞,用ELISA方法检测细胞上清液中TNF-α、IL-1β的含量。与正常组相比较,LPS组中TNF-α、IL-1β含量明显增多。两组TNF-α、IL-1β的含量有显著差异,差异有显著统计学意义(P﹤0.01),提示造模成功。6.通管丸含药血清对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症模型PPAR-γ、TRAF6基因表达影响(1)PPAR-γ在RAW264.7细胞中基因表达的差异空白对照组与PPAR-γ激动剂组进行比较,PPAR-γ基因的表达无明显差异,差异无统计学意义(P=0.148﹥0.05);空白对照组与无药血清组、通管丸含药血清组及NF-ΚB阻断剂组进行比较,空白对照组PPAR-γ基因的表达均明显高于其他三组,差异有显著统计学意义(P﹤0.01)。无药血清组与NF-ΚB阻断剂组、PPAR-γ激动剂组及通管丸含药血清组进行比较,无药血清组PPAR-γ基因的表达均明显低于其他三组,差异有显著统计学意义(P﹤0.01)。PPAR-γ激动剂组与NF-ΚB阻断剂组相比,PPAR-γ激动剂组PPAR-γ基因的表达明显高于NF-ΚB阻断剂组,差异有显著统计学意义(P﹤0.01);PPAR-γ激动剂组与通管丸含药血清组相比较,PPAR-γ激动剂组PPAR-γ基因的表达稍高于通管丸含药血清组,差异有统计学意义(P﹤0.05)。NF-ΚB阻断剂组与通管丸含药血清组进行比较,NF-ΚB阻断剂组PPAR-γ基因的表达明显低于通管丸含药血清组,差异有显著统计学意义(P﹤0.01)。(2)TRAF6在RAW264.7细胞中基因表达的差异空白对照组与无药血清组、PPAR-γ激动剂组、NF-KB阻断剂组及通管丸含药血清组进行比较,空白对照组TRAF6基因的表达明显低于其他四组,差异有显著统计学意义(P﹤0.01)。无药血清组与PPAR-γ激动剂组、NF-ΚB阻断剂组及通管丸含药血清组进行比较,无药血清组TRAF6基因的表达明显高于其他三组,差异有显著统计学意义(P﹤0.01)。通管丸含药血清组与NF-ΚB阻断剂组、PPAR-γ激动剂组进行比较,通管丸含药血清组TRAF6基因的表达低于NF-ΚB阻断剂组,而高于PPAR-γ激动剂组,差异均有统计学意义(P﹤0.05);NF-ΚB阻断剂组与PPAR-γ激动剂组进行比较,NF-ΚB阻断剂组TRAF6基因的表达明显高于PPAR-γ激动剂组,差异有显著统计学意义(P﹤0.01)。结论:1.LPS诱导的RAW264.7细胞炎症模型中,通管丸含药血清组PPAR-γ基因表达明显高于无药血清组,而通管丸含药血清组PPAR-γ表达稍低于PPAR-γ激动剂组,且通管丸含药血清组、PPAR-γ激动剂组PPAR-γ表达皆明显高于NF-ΚB阻断剂组,提示通管丸可能通过激活PPAR-γ,从而抑制NF-ΚB炎症信号通路,起到抗炎、抑菌作用,是通管丸治疗SOI的作用机制之一。2.LPS诱导的RAW264.7细胞炎症模型中,通管丸含药血清组TRAF6基因的表达明显低于无药血清组和NF-ΚB阻断剂组,稍高于PPAR-γ激动剂组,提示通管丸可能通过抑制TRAF6基因的表达,抑制NF-ΚB炎症信号通路,起到抗炎、抑菌作用,从而达到治疗输卵管炎性阻塞不孕的目的,是通管丸治疗SOI的又一种作用机制。