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目的:肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase,MLCK)是平滑肌细胞收缩的关键的调节蛋白,具有多种功能。它的结构组成包括N末端肌动蛋白结合区、中心激酶区催化区、钙调蛋白(calmodulin, CaM)结合区、C末端的肌球蛋白结合区。其中C末端是不依赖于MLCK而独立表达基因产物的,被称为端蛋白(telokin)。端蛋白与肌球蛋白结合组装成粗肌丝。MLCK激酶调节平滑肌收缩的机制已广为接受。然而生理条件下,平滑肌细胞在Ca2+浓度下降后仍维持一定程度张力,这用MLCK激酶调节机制难以解释。以往的研究显示MLCK860/1176(F6.5)可通过与肌球蛋白的头部相互作用而激活非磷酸化的肌球蛋白ATP酶活性。证明MLCK除了具有激酶活性外,还具有非激酶活性。本研究是在以往研究的基础上,进一步验证MLCK的非激酶调节作用,为阐明平滑肌收缩的非激酶调节机制提供有力的实验依据。方法:利用本实验室构建的MLCK表达载体(pGEX-F6.5)在大肠杆菌中进行表达;利用SDS-PAGE鉴定表达的MLCK;运用亲和层析技术纯化表达的MLCK。应用EnzChek磷分析试剂盒检测MLCK对磷酸化肌球蛋白及其水解重酶解肌球蛋白(heavy meromyosin,HMM)和肌球蛋白亚片段1(subfragment1, S1)Mg2+-ATP酶(简称ATP酶)活性的影响。体外检测MLCK对肌动蛋白肌丝运动的影响。结果:实验结果显示pGEX-F6.5可以在大肠杆菌中表达。SDS-PAGE显示表达的蛋白以可溶的形式存在。经Glutathione Sepharose 4B亲和层析纯化、SDS-PAGE鉴定得到单一的条带。应用EnzChek磷分析试剂盒分别测定不同浓度MLCK对磷酸化肌球蛋白、HMM和S1的ATP酶活性的影响。结果表明:MLCK对磷酸化肌球蛋白、HMM和S1的ATP酶活性均有明显激活作用,而且激活作用随着MLCK浓度的增加而增大,呈明显的量效关系。其中MLCK对磷酸化肌球蛋白ATP酶活性的影响表现为,当反应体系中加入肌动蛋白时,酶促反应动力学特征表现为:Vmax = 9.822±1.391(n=3), Km= 0.360±0.086(n=3);当反应体系中不加肌动蛋白时,酶促反应动力学特