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目的砷是一种广泛分布于自然界的金属性元素,且在很多国家和地区环境中其含量都超标。哺乳动物慢性砷暴露可引发多种癌变或非致癌性机体疾病,如皮肤癌、肺癌、心血管疾病、生殖系统疾病等,这些疾病的发生多伴随着活性氧(ROS)的大量生成和蓄积,过量的ROS会扰乱机体内的氧化-还原平衡,对机体造成氧化胁迫,同时损伤遗传物质——DNA,包括核DNA (nDNA)和线粒体DNA(mtDNA)。线粒体作为细胞的“动力工厂”,通过氧化磷酸化途径和三羧酸循环为细胞提供必需的ATP以维持细胞的正常生长和代谢；同时,线粒体也是细胞内ROS的重要生成场所,这便加大了mtDNA受氧化胁迫的可能性和氧化损伤水平。哺乳动物线粒体单一性来源于卵母细胞,卵母细胞内线粒体或mtDNA的损伤必将影响卵母细胞的成熟乃至整个受精卵的发育过程。探究砷污染引起的卵母细胞内线粒体及mtDNA损伤及其机制对进一步探索和预防砷引起的生殖障碍具有重要意义。砷暴露是否引起卵母细胞氧化胁迫,是否通过氧化胁迫导致mtDNA突变,其机制如何,尚未见系统的研究报道。本研究以雌性昆明小鼠卵母细胞为材料,结合体内、体外实验,通过使用不同浓度的三氧化二砷(As2O3)处理生发泡(GV)期的小鼠卵母细胞,结合常用活性氧清除剂N-Acety-L-Cysteine(NAC)及Tempo,利用体外细胞培养、活体染毒、半定量PCR、实时定量PCR、western blotting、荧光电镜等实验技术手段,着重探讨As203暴露对小鼠卵母细胞mtDNA的损伤效应及作用机制。方法1.As203对小鼠血液、肝脏及肾脏的氧化损伤作用本部分研究主要统计不同浓度砷暴露对小鼠体重、肝脏及肾脏脏器指数的影响,并检测砷在小鼠血液、肝脏及肾脏内的蓄积量以及在上述组织中的氧化胁迫水平(MDA含量及SOD、GSH-Px活力)。2.As203对卵母细胞线粒体及mtDNA的损伤作用该部分研究包括卵母细胞体外培养染毒和小鼠活体染毒两部分。主要检测砷染毒对小鼠卵母细胞的氧化胁迫水平以及对卵母细胞ATP含量、mtDNA完整性及拷贝数的影响。3.As2O3对卵母细胞mtDNA的损伤机制该部分研究同样包括卵母细胞体外培养染毒和小鼠活体染毒两部分。着重就As2O3对卵母细胞mtDNA的氧化损伤作用进行了验证,探究了溶酶体活性及mtDNA复制与修复蛋白mitochondrial transcription factor A (mtTFA)/DNA polymerase γ (polγ)对mtDNA完整性的调控作用。4.统计分析所有实验数据的统计与分析均采用SPSS16.0软件,用ANOVA和t-test统计分析各组间的差异性,p>0.05表明差异不显著,p<0.05表明存在显著差异。图形处理采用Origin8.0软件。结果1.砷能在小鼠血液、肝脏和肾脏内大量富集(p<0.05),富集量为肝脏>肾脏>血液；NAC联合干预能降低组织内砷的富集量(p<0.05)。2.砷能诱发小鼠血液、肝脏和肾脏内脂质过氧化水平升高,抗氧化指数(GSH-Px/MDA)下降(p<0.05),进而导致机体发生氧化损伤,而适量NAC的摄入则能清除砷所产生的过量活性氧(p<0.05),达到维持机体氧化－还原水平稳态,以保护机体免受砷导致的氧化损伤的目的。3.体内及体外研究表明,As2O3能诱导卵母细胞内ROS含量的大量增加,同时细胞内ATP含量显著降低(p<0.05),且mtDNA出现较严重损伤,具体体现为大片段缺失率增加,同时mtDNA拷贝数降低(p<0.05),说明As2O3可能通过氧化胁迫对线粒正常功能能造成影响。4.体内及体外研究表明,抗氧化剂NAC的联合作用有效抑制了As2O3诱导的ROS的爆发,同时砷暴露卵母细胞内ATP含量上升,mtDNA损伤程度降低(p<0.05),说明ROS可能是砷致mtDNA损伤的主要诱因。5.体内及体外研究表明,在As2O3处理组,随着mtDNA中8-OHdG含量的升高,线粒体基因组氧化损伤加剧,线粒体蛋白mtTFA和polγ表达水平显著下降(P<0.05)；而自由基清除剂NAC或Tempo则能有效提升mtTFA和pol y表达水平(p<0.05),同时缓解mtDNA氧化损伤,体现为mtDNA中8-OHdG含量降低(p<0.05)。6.体外染毒实验中,As203处理组卵母细胞内溶酶体活性升高,表现为β-gal活性显著升高(p<0.05),同时LysoTracker Red荧光强度增大；而自由基清除剂的联合作用有效降低了溶酶体活性(p<0.05)。总之,以上结果表明As203通过提高小鼠卵母细胞内ROS水平,降低线粒体内mtTFA和polγ蛋白表达水平,同时提高溶酶体活性诱发mtDNA氧化损伤,ROS在As203致卵母细胞mtDNA损伤过程中发挥着重要的介导作用。