论文部分内容阅读
硒是人体必需的微量元素之一,它主要以硒蛋白的形式存在于生物体内,并以硒酶的形式发挥其生物学功能,其中最重要的一种含硒酶是谷胱甘肽过氧化物酶(GPX;EC1.11.1.9)。GPX是一种重要的抗氧化剂,在机体抗氧化、清除自由基、防止细胞免受氧化损伤中扮演着重要的角色。然而,由于该酶来源有限、稳定性差,分子量大等因素的制约,大大限制了它的开发和利用。其在临床治疗和预防肿瘤、心脑血管疾病、炎症等疾病方面展示的美好前景,激发人们采取多种方法人工模拟GPX用于其催化机制和药理学研究。硒代半胱氨酸(Sec)是GPX的催化关键氨基酸,也是在各种抗氧化酶模拟物中引入GPX活力的有效基团。有趣的是,编码它的密码子是通常作为终止子的UGA,硒蛋白的广泛分布表明Sec的正常掺入需要一个特殊的调控机制。在Escherichia coli中,Sec的表达效率只有正常氨基酸的1-3%,因此硒蛋白的体内表达量非常低。而且,Sec插入依赖的原核生物硒代半胱氨酸插入序列(Selenocysteine Insertion Sequence,SECIS)需要紧邻编码Sec的UGA插入到其编码序列中,这势必影响硒蛋白的构象,从而使其丧失活性。然而在真核生物中,SECIS则位于mRNA 3’端非翻译区。在本研究工作中,我们首先利用硒蛋白真核生物合成元件,探讨异源硒蛋白在体外培养的哺乳动物细胞株中表达的可行性,并利用绿色荧光蛋白报告基因研究了硒蛋白真核表达的通读效率。然后,分别选用了与GPX具有共同催化底物的人Zeta族谷胱甘肽硫转移酶(hGST Z1-1)以及抗GSH的单链抗体2D8作为蛋白骨架,利用真核生物Sec插入机制在酶的活性中心定点引入GPX的催化氨基酸,并通过在硒蛋白真核表达载体中引入前导肽,实现了含硒蛋白在真核细胞中的分泌表达。本研究首次报道了利用真核生物基因工程方法将具有GSH结合位点的亲本蛋白转换成相应硒蛋白,而且利用这种方法得到的硒蛋白结构明确、催化位点单一。这一成果为进一步制备催化位点明确的小分子高活性的人源GPX模拟物奠定了良好的理论和实验基础。