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目的: 缺氧性肺动脉高压(hypoxic pulmonary hypertension,HPH)是一种由长期慢性缺氧引发的进行性肺心疾病。持续低氧造成肺动脉压力升高、肺动脉结构重塑(肺动脉管壁增厚及管腔异常狭窄),随病情进一步发展,右心室负荷持续加重,进而导致病人右心室衰竭及死亡。HPH的发病率和死亡率都较高,且目前尚无有效的治疗方法。 在HPH的病理发生与发展过程中,缺氧引发的肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs)增殖和肺部炎症细胞浸润都是非常关键的因素。因此,抑制PASMCs过度增殖及缓解肺部炎症成为防治HPH的热点思路。葫芦素B(cucurbitacin B,CuB)是一种从葫芦科植物中提取的四环三萜类化合物,具有较强的抗炎、抑制癌症细胞增殖、抗氧化等活性,可在多种病理过程中发挥重要的作用,如抑制乳腺癌、肝癌及肺癌细胞增殖,促进癌症细胞凋亡;诱发心肌细胞自噬;抑制巨噬细胞释放炎症因子;保护酒精所致的急性肝损伤性黄疸等。但CuB在HPH中的作用尚无报道。因此,本课题旨在通过建立HPH小鼠模型,探究CuB是否能够抑制PASMCs增殖及缓解肺部炎症来降低模型组小鼠的肺动脉压力、改善模型组小鼠的肺动脉血管重构以及右心室肥厚,以达到防治HPH的目的。 方法: 1.HPH小鼠模型建立及分组 选取32只雄性昆明小鼠(25-28g),随机分成4组,每组8只:①常氧+生理盐水组;②常氧给予CuB组;③低氧+生理盐水组;④低氧给予CuB组。将常氧组小鼠置于常氧(含21％O2)环境中,低氧组小鼠置于缺氧箱内(含10％O2),连续缺氧四周。 各组小鼠在缺氧前预给药一周后,连续给药四周,直至缺氧结束。第①组和第③组小鼠每天腹腔注射生理盐水,第②组和第④组小鼠每天腹腔注射CuB(1mg/kg)。 2.血流动力学与形态学分析 缺氧四周后,将各组小鼠麻醉,用聚乙烯(PE)导管经颈外静脉插入其右心室,测量右心室平均收缩压(right ventricular mean systolic pressure,RVSP),取出心脏,将右心室(right ventricle,RV)与左心室+室间隔(left ventricle+septum,LV+S)分离,计算其重量之比,用以评价右心室增厚程度。 将小鼠右肺组织固定(浸于4％多聚甲醛)、石蜡包埋、切片,苏木精伊红染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)观察肺动脉形态。Image Pro Plus软件分析肺动脉外径、内径、中膜面积、血管总面积,计算中膜厚度百分比(WT％)及面积百分比(WA％),以评价肺动脉增厚程度。 3.肺动脉结构重建免疫组化分析 小鼠肺组织经石蜡切片后,用α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle action,α-SMA)抗体进行免疫组织化学染色,然后分析测量α-SMA的光密度值(OD值),计算肺动脉肌化比例,以评价肺动脉重塑程度。 4.肺部炎症分析 提取各组小鼠肺组织中RNA,利用定量反转录聚合酶链式反应(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测肿瘤坏死因子-α(tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)与白介素-6(interleukin-6,IL-6)mRNA的表达情况。 提取各组小鼠左肺组织蛋白,利用蛋白免疫印迹(Western Blot)检测核转录因子κB(nuclear transcrlption factorκB,NF-κB)蛋白表达情况。 5.PASMCs原代培养及增殖分析 ①无菌条件下,分离3周龄左右昆明小鼠的肺动脉,采用Ⅱ型胶原酶消化的方法,原代培养PASMCs,2-7代可用。细胞实验分成6组:常氧组,低氧组,低氧+10μM CuB组,低氧+20μM CuB组,低氧+30μM CuB组,以及低氧+40μM CuB组。 ②MTT法检测低氧缺氧24h后,CuB对PASMCs增殖的影响。 ③Western blot检测缺氧诱导因子-1α(hypoxla inducible factor-1α,HIF-1α)、蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)与信号传导及转录激活因子3(signal transducers and activators of transcription3,STAT3)表达情况。 结果: 1.与常氧组相比,小鼠缺氧四周后,RVSP、RV/(LV+S)都显著升高。给予CuB处理后,RVSP、RV/(LV+S)显著降低。 2.与常氧组相比,小鼠缺氧四周后,肺动脉WT％、WA％、α-SMA的OD值及肌化比例显著升高。给予CuB处理后,肺动脉WT％、WA％、α-SMA的OD值及肌化比例显著降低。 3.与常氧组相比,缺氧组小鼠肺组织中TNF-α、IL-6的mRNA表达水平和NF-κBp65蛋白表达水平较常氧组显著升高。CuB可显著抑制缺氧小鼠肺组织中TNF-α、IL-6的mRNA过表达和NF-κB p65蛋白过表达。 4.与常氧组相比,缺氧显著促进PASMCs的增殖能力。CuB处理后,细胞增殖能力显著下降。 5.与常氧组相比,缺氧后,HIF-1α、p-Akt与p-STAT3蛋白在PASMCs中的表达显著上调。CuB剂量依赖性抑制以上蛋白的表达。 结论: 1.CuB能够降低缺氧性肺动脉高压模型小鼠的肺动脉血管压力,抑制肺动脉血管重构及右心室肥厚。 2.CuB能够下调缺氧性肺动脉高压模型小鼠肺组织中NF-κB p65蛋白表达水平,降低炎症因子TNF-α和IL-6的分泌量,进而改善缺氧引起的肺部炎症反应。 3CuB能够抑制缺氧引起的PASMCs过度增殖,下调HIF-1α、p-Akt与p-STAT3蛋白表达水平。