狂犬病是由狂犬病毒引起的,能感染人类和其它哺乳动物的传染性疾病,在已知的疾病中狂犬病的死亡率最高,一旦发病人和动物的死亡率几近100%。根据WHO建议,对于严重暴露者应进行暴露后预防(PEP),以获得快速的免疫保护。暴露后预防包含三个步骤:清洗伤口、接种疫苗和浸润注射免疫球蛋白。现在应用的免疫球蛋白为马源免疫血清(ERIG)和人源免疫血清(HRIG),但是由于ERIG副反应较大,而HRIG存在潜在的病原污染,且原料来源有限。单克隆抗体有可能取代ERIG和HRIG,但是其要用真核表达系统表达,表达量低,生产成本高,限制其进一步应用。因此,开发能替代HRIG,ERIG和单克隆抗体的基因工程抗体已十分迫切。单链抗体(Single chain variable fragment,scFv)是现在研究最多的小分子抗体,它是由连接肽将抗体重链可变区(VH)与轻链可变区(VL)相连而成,是具有其母体抗体全部抗原结合特异性的最小功能结构单位。它具有分子小、体内半衰期短、可通过包涵体大量表达、易于基因操作等优点。吉林大学的科研人员制备了抗狂犬病毒糖蛋白的单链抗体FV57S,在小鼠狂犬病毒攻毒实验中有保护功能,但是保护率只有60%,远远低于其母体的单克隆抗体。针对此问题,我们怀疑单链抗体的以下三点缺陷导致了其保护率较低。第一,单链抗体是单价的,即一个单链抗体只能结合一个抗原,而单链抗体的母体抗体为双价的,即一个完整的IgG抗体能结合两个抗原。第二,单链抗体存在两种排列方式,即从氨基端到羧基端依次为,VH-连接肽-VL和VL-连接肽-VH,FV57S为VH-连接肽-VL排列方式的单链抗体,这种排列方式可能抑制了 FV57S的正确折叠。第三,VH和VL的组装方式在单链抗体和IgG中是不同的,在单链抗体中VH和VL和是由连接肽共价相连的单一肽链,而在“Y”型结构的IgG中VH和VL是非共价连接的。为克服单链抗体是单价的缺点,通过缩短VH和VL之间的连接肽,把之前20个氨基酸长度的连接肽缩短到5个,这样将可能迫使2个单链抗体的VH和VL配对形成双价抗体Di-57S。但是,通过分子筛验证,没有形成双价的Di-57S,反而有大量没有活性的单体和多聚体出现。根据FV57S的序列,设计了 VL-连接肽-VH形式的单链抗体RFV57S。经Western-Blot和直接Elisa验证,RFV57S与HIS单抗的结合能力远远低于FV57S,从而导致利用HIS单抗的传统ELISA法无法正确比较RFV57S和FV57S的结合活性。利用生物素标记RV179,成功建立了能客观比较RFV57S和FV57S结合能力的新型ELISA,结果显示RFV57S的结合活性,亲和力,稳定性均高于FV57S。为克服VH和VL的组装方式在单链抗体和IgG中是不同这一缺点,构建了两条多肽链57VL-JUN-HIS和57VH-FOS-HA,在体外组装成zipFV57S,FOS和JUN为亮氨酸拉链多肽,通过FOS和JUN特异且高效的相互作用,从而导致zipFV57S中的VH和VL的组装方式和母体IgG中一致。利用ELISA法鉴定zipFV57S的结合活性,亲和力,稳定性均高于FV57S。利用RFFIT法在细胞水平上证实Di-FV57S没有中和活性,并证实zipFV57S单体,RFV57S单体相比较FV57S单体中和狂犬病毒的作用分别提高了 53%和25%;用小鼠中和试验(MNT),在动物水平上验证了zipFV57S,RFV57S中和狂犬病毒(RV)的作用,相比较FV57S,RFV57S的保护率提高了 33%,zipFV57S单体的提高了 66%并且与HRIG相同。综上所述,通过缩短连接肽长度,使单链抗体变为双价的尝试没有成功;RFV57S保护率有所提高但是仍低于HRIG;而zipFV57S与HRIG的保护率相似,因此zipFV57S有望替代目前应用的HRIG成为抗狂犬病毒中和抗体的候选者。