【摘 要】
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几丁质是在自然界中除了纤维素之外,生成量为第二大的多糖类物质。它是由β-1,4糖苷键连接N-乙酰葡萄糖胺结构单元聚合而成的直链聚合物,广泛存在于昆虫的表皮、气管和中肠,能够保护昆虫免受外界侵害。参与几丁质新陈代谢的酶在昆虫的发育中起着重要作用,因此受到人们的广泛关注,是重要的潜在农药设计的靶标。AA15家族的裂解性多糖单加氧酶（LPMO）是近几年才发现的一类依赖铜离子的酶,参与昆虫几丁质的降解过程
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几丁质是在自然界中除了纤维素之外,生成量为第二大的多糖类物质。它是由β-1,4糖苷键连接N-乙酰葡萄糖胺结构单元聚合而成的直链聚合物,广泛存在于昆虫的表皮、气管和中肠,能够保护昆虫免受外界侵害。参与几丁质新陈代谢的酶在昆虫的发育中起着重要作用,因此受到人们的广泛关注,是重要的潜在农药设计的靶标。AA15家族的裂解性多糖单加氧酶（LPMO）是近几年才发现的一类依赖铜离子的酶,参与昆虫几丁质的降解过程。它能够通过氧化裂解的方式断裂几丁质,从而显著提高几丁质酶的降解效率。但是,目前对于该家族LPMO活性的认识十分匮乏,揭示其催化活性将进一步阐明昆虫几丁质降解的机制,并有助于实现几丁质生物质资源的利用。本论文选取亚洲玉米螟中AA15家族的裂解性多糖单加氧酶（OfLPMO1）作为研究对象,主要开展了以下研究工作:（1）OfLPMO1的载体构建和诱导表达。成功构建亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）AA15家族裂解性多糖单加氧酶（OfLPMO1）催化域及全长的酵母表达载体（OfLPMO1-CD、OfLPMO1-FL）,转入毕赤酵母内实现可溶表达。并利用几丁质吸附的方法来实现初步纯化,获得的目的蛋白OfLPMO1-CD和OfLPMO1-FL,其实际分子量分别为21 k Da和35 k Da,产量分别为7 mg/L和13.4 mg/L。（2）建立测定LPMO的活性方法。以2,6-二甲氧基苯酚（2,6-DMP）和H2O2为底物,以微生物（Bacillus thuringiensis）来源的裂解性多糖单加氧酶（BtLPMO10A）为对象,建立了测定LPMO活性的评价体系,并应用该方法发现底物的加入有助于提高该酶的稳定性。（3）OfLPMO1的酶学性质研究。通过比较发现,OfLPMO1-FL催化底物氧化和结合底物的的活性高于OfLPMO1-CD;OfLPMO1与β-几丁质的结合能力远强于α-几丁质;OfLPMO1的氧化活性和底物的结合均依赖Cu2+。（4）应用OfLPMO1降解几丁质。OfLPMO1-FL降解几丁质的能力强于细菌来源的BtLPMO10A,通过电子显微镜观察发现其可以明显破坏几丁质的致密结构,使其坍塌,表面变得蓬松多孔。OfLPMO1与几丁质酶Of Chi-h、SmChiA、SmChiB和SmChiC在降解几丁质的过程中存在协同作用。
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