本项科研工作来源于2011年国家自然科学基金。研究背景：类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis, RA)是一种以慢性侵蚀性关节炎为特征的全身性自身免疫性疾病。类风湿关节炎的病变特点为滑膜炎,以及由此造成的关节软骨和骨质破坏,最终导致关节畸形。如果不经过正规治疗,约45%的患者在10年内可出现残废。类风湿关节炎广泛分布于世界各地,其发病具有一定的种族差异,在不同人群中的患病率为0.18%-1.07%。类风湿关节炎在各年龄中皆可发病,高峰年龄在30～50岁左右,一般女性发病多于男性。随着我国老龄化社会的出现,RA的患病人群不断增加,如RA病人不能得到早期的诊断和治疗,将给社会和家庭造成沉重的负担。因此,针对RA发病机理的研究和寻找新的早期诊断和治疗的靶点和手段是风湿病学界的一项重要课题和刻不容缓的使命。RA的主要病理改变包括血管翳的形成以及后期导致的软骨和骨的破坏。滑膜细胞是最主要的效应细胞,TNF-α和IL-1是最重要的细胞因子。在疾病早期,滑膜充血水肿,间质中有单核细胞、多形核细胞及淋巴细胞浸润。经3-6月,渐渐转变成RA典型的慢性滑膜炎,滑膜增生呈绒毛状突入滑膜腔；免疫活性细胞大量增殖浸润,侵入的单个核细胞集聚在一起形成淋巴样滤泡,少数发展成生发中心；在小血管周围的滤泡内,浆细胞、巨噬细胞及淋巴细胞共同形成结节状血管翳(Pannus)。血管翳持续增长扩张,覆盖于关节软骨面,阻断软骨与滑液的接触,影响其营养摄取。血管翳中免疫活性细胞释放出许多炎性介质及蛋白水解酶、胶原酶等,对关节软骨、软骨下骨、韧带、肌腱等组织进行侵蚀,引致关节软骨破坏、软骨下骨溶解、关节囊破坏松弛、关节错位、关节融合,以致骨化,最终使关节功能完全丧失。RA的发病机制复杂,至少有八种细胞类型参与,包括：肥大细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞、树突状细胞、软骨细胞和破骨细胞,这些细胞通过表面的受体、分泌的细胞因子、趋化因子、组织蛋白酶、基质金属蛋白酶等相互作用,形成一个复杂的网络。如滑膜肥大细胞可能通过产生大量碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、LTC4和PDGF等调节因子促使成纤维样细胞增殖；并可调节成纤维样细胞的促炎性活性,如促使成纤维细胞表达组织蛋白酶和基质金属蛋白酶等效应分子,导致软骨和骨的破坏。肥大细胞自身可能也表达低水平的组织蛋白酶如Cathepsin G,和分泌MMP-2、-9等,共同参与软骨和骨的破坏。RA滑膜巨噬细胞和滑膜成纤维细胞(rheumatoid arthritis synovial fibroblasts, RASFs)是增生的滑膜组织内两种主要的细胞类型。巨噬细胞在RA中具有促炎性、破坏性和重塑性潜能,在急性和慢性RA的炎症和关节破坏中起作用。巨噬细胞活化可募集单核细胞和其它的单核吞噬细胞系统,包括骨髓单核细胞系的骨髓前体细胞和破骨细胞。在RA中,两种主要的促炎性细胞因子TNF-α和IL-1都是由巨噬细胞产生。因此可认为巨噬细胞是病变局部和全身性炎症反应的放大器。1983年Fassbender第一次报道RASFs表型,使我们了解了本来一种正常的间质细胞变成了一种在RA中起主要破坏作用的细胞。RASFs可以不依赖炎症反应而被活化,除分泌趋化蛋白外,RASFs可产生一系列促炎性细胞因子和效应分子。RASFs在滑膜衬里层是环氧化酶(COX)-2的来源,通过COX-1/COX-2途径参与滑膜内炎性途径的调节。在关节软骨和骨的破坏中起作用的效应分子是基质金属蛋白酶(MMPs)和组织蛋白酶。位于侵蚀部位或滑膜衬里层的RASFs是MMPs和组织蛋白酶的主要来源之一,并通过这些酶驱动RA关节破坏。在正常滑膜中存在肥大细胞,约占滑膜表面细胞的3%；而在RA患者滑膜中肥大细胞数量增长5-24倍,可占到滑膜表面细胞的5%。滑膜肥大细胞常聚集于血管翳和软骨交界处及血管翳侵入骨皮质处。肥大细胞可能是以一种不同于过敏反应中快速脱颗粒,被称为“缓慢脱颗粒”或“选择性脱颗粒”的方式参与RA的发病。Boseila等于1961年第一次报道肥大细胞在RA发病中可能起作用。但此后多年,未有大的研究突破,直至2002年David M. Lee等发现肥大细胞缺失的w/wV和Sl/Sld小鼠对致关节炎的K/B×N血清抵抗,不会形成关节炎；而这种抵抗可被植入野生型肥大细胞所消除,确认了肥大细胞在免疫复合物介导的关节炎中起关键作用。组织蛋白酶S是属于木瓜蛋白酶超家族的一种半胱氨酸蛋白酶,在抗原提呈细胞(antigen presenting cell, APCs)上高度表达,它对多种蛋白具有催化水解活性,特别是MHCⅡ恒定链(invariant chain, Ii)和细胞外基质成份(弹性蛋白和胶原)。已证实组织蛋白酶S参与多种疾病,如Alzheimer’s病、动脉粥样硬化、哮喘、慢性阻塞性肺病、肿瘤、骨关节炎、神经痛和多种自身免疫性异常等。目前对组织蛋白酶S在RA中的作用研究较少。最初研究发现,在组织蛋白酶S敲除小鼠中,对胶原诱导关节炎的敏感性显著降低,开始有学者尝试用组织蛋白酶S的抑制剂来治疗RA。此后研究证实,组织蛋白酶S在滑膜中主要由巨噬细胞表达,而成纤维细胞不表达。在RA的滑液中组织蛋白酶S水平可显著升高。在原发性干燥综合征的小鼠模型中发现用组织蛋白酶S的特异性抑制剂(Clik60)可明显减少淋巴细胞浸润,抑制自身抗体产生,促使临床症状的缓解。进一步说明组织蛋白酶S在自身免疫性疾病的抗原提呈和器官特异性自身免疫病的发生、发展中起重要作用。研究目的：目前国际上对组织蛋白酶S的研究仍较少,且多集中在其抑制剂的制备、慢性神经源性疼痛和肿瘤等方面。根据组织蛋白酶S的作用特点及其他学者的研究,我们提出假说：在RA的发病机制中,组织蛋白酶S除主要的抗原提呈作用外,还在血管翳的形成、细胞外基质的降解及其它蛋白酶的激活中起重要作用,但它的作用可能在RA的早期更显著。为验证上述假说,我们先进行临床研究,选取符合ACR1987年诊断标准的RA病人,检测其外周血中表达组织蛋白酶S的变化,确认RA病人体内确有组织蛋白酶S表达增多,并与DAS-28和类风湿因子相关。完成临床研究后,再选取C57BL/6小鼠,原代培养小鼠腹腔巨噬细胞、滑膜成纤维细胞、关节软骨细胞和骨髓源性肥大细胞进行体外研究,检测细胞上清中组织蛋白酶S和Ⅱ型胶原的变化。研究方法：在本研究中,我们收集29个类风湿关节炎病人的血清,其中5个病人进行7次随访,共36例标本。检测血清中组织蛋白酶S、Ⅱ型胶原、IL-17A和TNF-α等指标,用GraphPad Prism5.01和SPSS13.0统计软件进行统计学分析,对正态分布的数据用Mean±SD表示,对两组间数据对比采用t检验方法；对两组间数据相关分析采用Pearson方法；对三组及以上数据间对比采用One way ANOVA方法。对非正态分布的变量用Median±Q表示,对两组间数据相关分析采用Spearman方法；对三组及以上数据采用非参数统计方法,主要是Kruskal-Wallis方法。以上统计方法均以P<0.05有统计学差异。在细胞培养部分中,我们共进行了四种原代细胞的培养,包括小鼠滑膜成纤维细胞、腹腔巨噬细胞、关节软骨细胞和骨髓源性肥大细胞。我们对上述四种原代培养细胞进行多种方式的共培养。研究结果：我们发现血清中组织蛋白酶S的表达远高于正常对照组,而且其表达水平高低与类风湿关节炎的疾病活动度相关,并与类风湿因子的高低相关,但与抗CCP抗体的基线水平无关。同时,我们检测了血清中Ⅱ型胶原的水平,后者与类风湿关节炎的疾病活动度、类风湿因子和抗CCP抗体的基线水平均无关,但血清中Ⅱ型胶原的水平与组织蛋白酶S的水平呈弱的负相关(r=-0.3812,P=0.0207)。在此研究的基础上,我们又收集了18例类风湿关节炎、7例膝骨关节炎和10例痛风患者的膝关节滑液,检测上述关节炎滑液中组织蛋白酶S、IL-17A和Ⅱ型胶原的表达水平,发现组织蛋白酶S在类风湿关节炎和痛风病人的滑液中均显著升高(P=0003); IL-17A在类风湿关节炎滑液中均表达,且远高于骨关节炎和痛风病人(P=0.004),而IL-17A在后两种疾病的少部分患者的滑液中可检测到低水平的表达。一般认为,滑液中Ⅱ型胶原的水平可作为软骨破坏的一个衡量指标,但奇怪的是在本研究中,骨关节炎病人的滑液中检测不到Ⅱ型胶原的表达,而类风湿关节炎病人的滑液中有较高水平的Ⅱ型胶原的表达(P<0.0001)。该研究显示类风湿关节炎病人的血清中和滑液中均有组织蛋白酶S的高表达,且血清中组织蛋白酶S的表达水平与类风湿关节炎疾病活动度、类风湿因子的高低相关,与抗CCP抗体的基线水平无关。从对类风湿关节炎、膝骨关节炎和痛风患者的膝关节滑液的研究上看,组织蛋白酶S有可能参与多种炎性关节病的病理过程。在本研究中,我们共进行了四种原代细胞的培养,包括小鼠滑膜成纤维细胞、腹腔巨噬细胞、关节软骨细胞和骨髓源性肥大细胞。其中,对小鼠滑膜成纤维细胞的原代培养进行了改进,改变既往的收集双膝关节内滑膜,而改为体积更大的双髋关节外的滑膜,获得了更高的纯度,经过Vimentin、D90.2、CD54等表面标志物的流失细胞分析验证,证实为滑膜成纤维细胞。对骨髓源性肥大细胞的原代培养,目前市售的重组IL-3的效果差强人意,换用重组小鼠IL-3菌株获得的纯化IL-3后,可以更好地培养肥大细胞。我们对上述四种原代培养细胞进行了实验,发现软骨细胞在与滑膜成纤维细胞共培养时,后者有可能会抑制软骨细胞分泌CⅡ,或者解释为可能滑膜成纤维细胞会分泌某种物质破坏软骨细胞分泌的CⅡ；而软骨细胞与肥大细胞的共培养时,发现加入APC366(一种类胰蛋白酶抑制剂)后,上清中CⅡ表达升高；而在C48/80(一种肥大细胞的激活剂)组中,上清中CⅡ表达显著下降。说明肥大细胞在激活后可能抑制软骨细胞分泌CⅡ,或者肥大细胞在激活后破坏软骨细胞分泌的CⅡ。而在抑制了肥大细胞内的类胰蛋白酶后,可导致软骨细胞分泌CⅡ增加或者认为肥大细胞破坏软骨细胞分泌的CⅡ能力下降。在上述四种细胞中,只有巨噬细胞的培养上清中可以检测到组织蛋白酶S的表达,且这种表达受到TNF-α的影响。在肥大细胞与巨噬细胞共培养时,肥大细胞可诱导巨噬细胞表达组织蛋白酶S增加,而在抑制肥大细胞的类胰蛋白酶后(加入APC366)可进一步增加组织蛋白酶S的表达。肥大细胞在完全激活后可能具有抑制组织蛋白酶S表达的作用。在原代细胞的研究中,虽然我们投入了大量的精力,但获得更多的是阴性结果,如未检测到上述四种细胞上清中有IL-17A、IL-1β(结果未列出,ELISA法)等细胞因子的表达；在肥大细胞、滑膜成纤维细胞和软骨细胞的提取蛋白进行Western blot,未检测到组织蛋白酶G、C、K或S的存在,仅在巨噬细胞的蛋白提取中见到一条弱的组织蛋白酶S的条带存在。研究结论：组织蛋白酶S在类风湿关节炎病人的血清和膝关节液中表达水平显著升高,说明其在类风湿关节炎的发病机制中起一定作用。对四种原代细胞的培养证实组织蛋白酶S主要是由巨噬细胞表达。肥大细胞不表达组织蛋白酶S,但其对软骨细胞表达Ⅱ型胶原的影响较大。