论文部分内容阅读
目的:本研究目的是探讨细胞外信号调节激酶（Extracellular signal regulated kinase,ERK1/2）信号通路在动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）病理性心肌缺血/再灌注（Ischemia/reperfusion,I/R）损伤中的作用机制及靶向干预效果。探讨外源性靶向转导组成性激活的MEK1基因（Constitutively active MEK1,CaMEK）能否通过激活ERK1/2通路,调节自噬水平、抑制心肌细胞凋亡、以及改善线粒体功能等方面减轻I/R损伤。本研究主要包括:（1）利用载脂蛋白E基因敲除(Apolipoprotein E knock-out,ApoE-/-)的小鼠,并给予高脂饮食建立AS模型,对比研究缺血后适应（Ischemic post-conditioning,IPost）对健康小鼠与AS小鼠心肌保护作用的差异,及其对ERK1/2信号通路活性的影响。（2）在细胞水平,通过体外转染携带CaMEK基因的重组双链9型腺相关病毒（Recombinant double strand adeno-associated virus serotype 9-CaMEK,dsAAV9-CaMEK）病毒载体,利用乳鼠心肌细胞分别建立缺氧/复氧（Hypoxia/reoxygenation,H/R）和氧化应激损伤模型,探讨CaMEK基因过表达防治心肌细胞H/R损伤及氧化应激损伤的作用及其分子机制。（3）在组织及动物整体水平,通过离体及在体心肌I/R模型,研究CaMEK基因靶向心脏表达对抗AS心肌I/R损伤的效果及其机制。方法:（1）首先选取8周龄的C57BL/6J和ApoE-/-雄性小鼠为研究对象,分别用常规饲料和高脂饲料喂养。在喂养4个月后检测ApoE-/-小鼠主动脉粥样硬化程度,同时建立两种小鼠的在体IPost模型。检测指标为心肌梗死面积、心肌酶、心肌细胞凋亡指数、ERK1/2信号通路相关蛋白的表达。（2）将携带增强型绿色荧光蛋白（Enhanced green fluorescent protein,eGFP）的dsAAV9及dsAAV9-CaMEK病毒载体转染乳鼠心肌细胞,利用荧光显微镜检测dsAAV9载体的体外转染效率,并利用Western blot评价CaMEK基因过表达对ERK1/2信号通路活性的影响。分别建立缺氧/复氧及氧化应激损伤模型。主要检测指标为心肌细胞凋亡、线粒体膜电位（Δψm）、ERK1/2信号通路关键蛋白和自噬相关蛋白的表达。（3）选取8周龄的ApoE-/-雄性小鼠用高脂饲料喂养4个月,经尾静脉分别注射dsAAV9-eGFP及dsAAV9-CaMEK病毒载体。转染5周后,分别建立离体和在体的心肌缺血/再灌注损伤模型。观察指标主要为心肌梗死面积、细胞凋亡、ERK1/2信号通路关键蛋白和自噬相关蛋白的表达。在体心脏再灌注1个月后使用心脏超声评价小鼠心功能,并用Masson染色评价损伤后心肌纤维化情况。结果:（1）（1）缺血后适应对AS小鼠心肌没有保护作用,I/R组和IPost组的心肌梗死面积、凋亡、心肌酶水平等均无明显差异（P>0.05）。（2）缺血后适应通过激活健康小鼠心肌ERK1/2、p70S6K发挥心肌保护作用,但是IPost处理并不能有效激活AS小鼠心肌ERK1/2通路。（2）（1）dsAAV9载体转染5天时,GFP蛋白及MEK蛋白在心肌细胞中高表达。（2）各组心肌细胞经历H/R及H2O2刺激后,CaMEK组心肌细胞凋亡指数较对照组显著下降（P<0.01）,线粒体膜电位提高、细胞活力上升、乳酸脱氢酶水平下降。同时ERK1/2信号通路激活抑制了心肌细胞的过度自噬效应,给予抑制剂PD98059取消CaMEK基因的心肌保护作用。（3）（1）在离体心肌I/R损伤模型中,CaMEK基因过表达有效保护AS小鼠心肌免受I/R损伤。空病毒组、CaMEK基因转导组I/R的心肌梗死面积分别为30.88±2.25%vs.21.09±1.58%（P<0.01）,CaMEK基因转导能高效激活AS心肌ERK1/2信号通路,有效减少心肌细胞凋亡、抑制I/R损伤后的过度自噬效应。（2）对于在体I/R研究,CaMEK基因过表达同样可有效降低AS小鼠心肌梗死面积,GFP组及CaMEK组的心梗面积分别为43.41±2.47%vs.27.47±1.90%（P<0.05）;CaMEK基因靶向表达减少AS心肌细胞凋亡,降低心肌酶水平,差异有统计学意义（P<0.01）。此外,CaMEK基因转导可高效激活I/R后AS心肌的ERK1/2-p70S6K-GSK3β信号通路,并抑制I/R损伤后的自噬水平。（3）与GFP组相比,CaMEK组在I/R术后1月心肌的左心室收缩末期面积（Left ventricular end-systolic area,LVESA）和左心室收缩末期容积（Leftventricular end-systolic volume,LVESV）值显著降低,射血分数（Ejection fraction,EF）、面积变化分数（Fractional area change,FAC）值显著增加,差异有统计学意义（P<0.05）。结论:（1）缺血后适应对AS小鼠心肌I/R没有保护作用与ERK1/2信号通路未进一步激活有关。（2）外源性导入CaMEK基因,可以通过激活ERK1/2信号通路抑制心肌细胞的自噬水平,减少因H/R及H2O2造成的心肌细胞凋亡,且能够稳定线粒体功能,提高心肌细胞活力,从而减轻H/R及氧化应激对心肌细胞造成的损伤。（3）靶向激活心肌ERK1/2信号通路可以通过抑制自噬、稳定线粒体功能、减少凋亡、缩小梗死面积、改善远期心脏功能等多种效应,最终防治AS心肌I/R损伤,CaMEK基因靶向转导有望成为AS心肌对抗缺血/再灌注损伤的有效手段。