【摘 要】
：
目的酵母双杂交技术证实phb1与CLIC1在酵母中的相互作用;构建带FLAG标签的phb1真核表达载体和带GFP标签的CLIC1真核表达载体;将其共转染至COS7细胞,观察其在哺乳细胞株内的共定位的具体情况;转染至HEK293T细胞,进行免疫共沉淀,检测在哺乳动物细胞内phb1蛋白与CLIC1蛋白能否相互结合。方法以含人phb1全长cDNA序列的质粒pLenti6-phb1为模板,用PCR方法扩增
论文部分内容阅读
目的酵母双杂交技术证实phb1与CLIC1在酵母中的相互作用;构建带FLAG标签的phb1真核表达载体和带GFP标签的CLIC1真核表达载体;将其共转染至COS7细胞,观察其在哺乳细胞株内的共定位的具体情况;转染至HEK293T细胞,进行免疫共沉淀,检测在哺乳动物细胞内phb1蛋白与CLIC1蛋白能否相互结合。方法以含人phb1全长cDNA序列的质粒pLenti6-phb1为模板,用PCR方法扩增phb1全长序列,双酶切后回收目的片段,连接到载体pGADT7上,构建酵母表达载体pGADT7-phb1;双酶切pGADT7-phb1回收目的片段,连接到载体pGBKT7上,构建载体pGBKT7-phb1;以pACT2-CLIC1为模板,用PCR方法扩增CLIC1全长序列,BamHⅠ单酶切回收目的片段,连接到pGBKT7上,构建酵母表达载体pGBKT7-CLIC1和pGADT7-CLIC1。把测序正确的酵母表达载体分组转化至酵母菌AH109,在SD/-Leu/-Trp/-His/+3-AT/X-α-gal盘上筛选蓝色的克隆。呈蓝色的克隆是α-gal活性为阳性的克隆,再通过滤膜印迹实验测定β-半乳糖苷酶活性进一步验证它们的相互作用情况。用PCR方法扩增phb1全长序列构建真核表达质粒pCDNA3-FLAG-phb1,后转染至COS7细胞,在荧光显微镜下观察其在细胞的定位;将构建正确的质粒pCDNA3-FLAG-phb1和pCDGFP-CLIC1共同转染至COS7细胞,通过免疫荧光显微镜观察phb1蛋白和CLIC1蛋白在细胞内的共定位情况;将质粒pCDNA3-FLAG-phb1和pCDGFP-CLIC1共同转染至HEK293T细胞,提取细胞裂解液,进行免疫共沉淀,后通过Western blot检测在哺乳动物细胞内phb1蛋白与CLIC1蛋白能否结合。结果经酶切和测序鉴定,各组质粒均构建正确。营养筛选及α,β-半乳糖苷酶活性的测定均表明phb1和CLIC1能相互作用;pCDNA3-FLAG-phb1和pCDGFP- CLIC1转染至COS7细胞中,免疫荧光显微镜观察phb1和CLIC1共定位于细胞核周围区域;免疫共沉淀和Western blot检测证明phb1蛋白和CLIC1蛋白在HEK293T细胞中相互结合。结论酵母双杂交系统3初步证实phb1和CLIC1之间存在相互作用;免疫荧光显微镜观察pCDNA3-FLAG-phb1和pCDGFP-CLIC1在COS7细胞中存在共定位,主要聚集于胞质中;免疫共沉淀和Western blot检测进一步证明phb1蛋白和CLIC1蛋白在哺乳动物细胞中相互结合。
其他文献
高速列车车体结构的轻量化设计以及动力分散的布置理念,使得车体与车下设备之间的耦合振动问题日益显现,并造成旅客乘坐舒适性降低、吊挂结构可靠性下降和产生异常噪声等一系列的实际应用问题。另外,考虑到结构所承受的载荷是造成其振动的直接原因。因此,本论文从车体与车下设备耦合振动和吊挂载荷识别这两个方面出发开展相应的基础研究,主要内容包括:（1）建立了高保真度的垂向刚柔耦合线性简化模型,利用时域和频域方法对车
第一部分KzNF家族《ABxz型)真核表达载体pCMVMyc—KzNFs的构建与P53的转录因子活性调节子的筛选目的构建KzNF家族（ABXZ型）真核表达载体pCMVMyc—KzNFs，用于筛选KzNF家族中P53调控分子。筛选对于P53转录因子活性有影响的真核表达载体pCMVMyc—KzNFs，用于深入筛选。方法利用试剂盒从多种细胞中提取RNA，并逆转录得到cDNA，利用合成的引物，用PCR的方
多层配送中心的应用在满足物流企业大容量仓储需求的同时,也对其内部的产品货位布局带来挑战。合理的产品布局,有助于提升系统分拣效率、加快产品周转,快速响应客户需求,提高客户满意度。但多层配送中心的货位指派问题由于受到订单需求、产品特征、分拣策略、电梯运输等多重因素的作用,影响机理复杂,建模及求解往往较为困难。基于此,本文通过构建分拣-电梯排队网络,分析各个系统与产品货位指派的相互影响关系,获取订单在层
近年来我国乡村面源污染问题日益突出,逐渐成为农村水环境整治的瓶颈。而随着LID体系被越来越多地区接受并应用,国内学者们开始陆续将LID应用于乡村地区的面源污染治理中,但目前尚未形成成熟的理论与技术应用体系,关于LID措施选址的研究则更为稀缺,有待进一步完善补充。因此,本研究以乡村面源污染防治为切入点,将低影响开发理念引入乡村面源污染治理中,结合成都平原地区乡村流域特点,以具有典型成都平原乡村流域特
目的:探讨灯盏花素眼部雾化辅助治疗2型糖尿病非增殖期糖尿病视网膜病变早期患者的临床疗效和安全性。通过观察对照组和观察组视力、眼底情况、中医证候积分、各血糖指标、血管内皮生长因子、色素上皮衍生因子、肿瘤坏死因子-α、一氧化氮因子、临床疗效以及不良反应,并根据观察结果进一步分析灯盏花素眼部雾化辅助治疗2型糖尿病非增殖期糖尿病视网膜病变早期患者的依据,为中医适宜技术防治糖尿病视网膜病变提供理论依据,同时
受电弓气动抬升力是弓网接触力的重要组成部分,随着列车运行速度的提高,受电弓气动抬升力的改变对弓网接触力的影响加剧。受电弓有开口和闭口两种运行方式,但受电弓纵向结构不对称,开闭口运行工况下受电弓气动抬升力也不相同,在列车运行方向改变后还需调节气囊系统以调节静态抬升力。因此,优化受电弓气动抬升力并保证开闭口运行工况下受电弓气动抬升力的一致性对减缓气囊系统的疲劳损坏、降低弓网事故发生率有重要意义。本论文
螺栓连接作为工程应用中重要的连接部件,在温度、振动、冲击等服役环境中,易出现松动失效现象,从而导致连接结构失效。因此,国内外学者不断致力于螺栓连接的松动机理及防护方法研究,但是温度和振动耦合作用下螺栓连接结构松动失效的相关研究较少。本论文重点开展了温度和横向载荷耦合作用下螺栓连接的松动行为研究,这对交变温度及振动环境下螺栓连接的实际工程应用、拓展等方面具有重大意义。本论文设计了螺栓连接松动试验夹具
饮酒是很多国家宗教、文化及社会习俗的一部分,然而,在世界卫生组织发布的最新全球饮酒与健康状况报告中指出,每年约有330万人因有害使用酒精而死亡,占全球总死亡人数的5.3%。报告显示,在全球范围内,除中国以外,人均酒精消费量呈下降趋势,但中国酒精消费持续上升,形势不容乐观。据统计,在亚太地区,每年约有30万人死于因饮酒引发的相关疾病。由于肝脏是酒精代谢的关键场所,同时也是最早和受损最大的组织,所引发
伴随着新时代交通强国、铁路先行的发展需要,我国重载铁路货车朝着重载快捷的方向快速发展。为提高车辆运营可靠性及经济性,需根据车辆实际运用状态对关键结构部件的服役寿命进行评估。交叉支撑结构作为关键部件之一,对提高车辆的抗菱形刚度、抗蛇行失稳能力以及临界速度至关重要。本文以当前我国重载铁路货车主型转向架的交叉支撑结构为研究对象,通过台架试验、线路测试、仿真分析及理论等手段,结合检修及运用要求对其服役寿命
研究目的1 探讨反复呼吸道感染（Recurrent Respiratory Tract Infection,RRTI）患儿体质分型规律,并分析影响小儿RRTI发生的相关性因素,为中医药防治小儿RRTI提供参考依据;2通过检测RRTI患儿、健康儿童血清维生素A（Vitamin A,VA）、维生素E（Vitamin E,VE）及IgA、IgG、IgM的水平,探讨RRTI与患儿血清VA、VE及Ig水平的