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背景:大鼠SHARP-2蛋白是归属重要转录因子basic helix-loop-helix(bHLH)蛋白质家族,在小鼠和人的相应的蛋白质为Stra13和Dec1。SHARP-2转录因子在细胞增殖,分化,肿瘤形成的起了重要的作用。我们的前期研究表明TGF-β可促进SHARP-2的表达,而SHARP-2转录因子又可促进IL-2的分泌。以及在Stra13敲除小鼠中INF-γ和IL-2的表到下降,由此推测SHARP-2基因在器官移植中具有重要的作用。我们借助于RNA干扰技术,通过靶向抑制SHARP-2的表达,来研究SHARP-2在器官移植中的作用。RNA干扰主要是通过dsRNA被核酸酶切割成21-23 bp的siRNA双链,进而由RNA诱导的沉默复合体(RNAinduced silencing complex,Risc)分离并结合,后者在siRNA反义链的介导下识别并靶向切割同源性mRNA而阻止基因的翻译过程。通过构建shRNA表达载体,在细胞内表达shRNA,通过Dicer酶的作用下形成siRNA分子,达到对目的基因的沉默。目前腺病毒载体作为RNA干扰载体已有长足的发展,并能够在哺乳动物细胞中达到目的基因的长时程抑制。课题组获得国家自然基金资助,本课题作为基础,构建了特异性SHARP-2基因RNA干扰的腺病毒载体系统,为SHARP-2基因在器官移植中的作用研究奠定基础。目的:构建转录SHARP-2基因小发夹RNA(SHARP-2-shRNA)的腺病毒(Rad-hSHARP)。方法:一、设计能转录SHARP-2-shRNA模板的两对DNA序列,退火后克隆至PDC316-EGFP-U6质粒,构建重组质粒PDC316-SHARP-shRNA。二、将PDC316-SHARP-shRNA与腺病毒骨架质粒pBHGloxdelEl3cre共转染293细胞,进行腺病毒载体(Rad-hSHARP)的构建。三、提取重组腺病毒的DNA,PCR鉴定正确者即为正确序列插入的重组腺病毒Rad-hSHARP。四、在NRK细胞中对重组腺病毒干扰效果的鉴定。结果:一、测序鉴定表明PDC316-SHARP-shRNA构建成功。二、穿梭载体和骨架质粒共转染293细胞成功构建重组腺病毒颗粒,滴度较高。三、PCR测序鉴定表明重组腺病毒(Rad-hSHARP)包含目的基因序列的插入。四、RT-PCR表明重组腺病毒在NRK细胞中有干扰效果。结论:成功构建转录SHARP-2基因小发夹RNA(SHARP-2-shRNA)的腺病毒(Rad-hSHARP),为利用特异性沉默SHARP-2基因在器官移植中的作用研究奠定基础。