卵巢癌是第三位常见的女性恶性生殖系统肿瘤，但是其死亡率却是最高的。尽管针对卵巢癌的基础研究已经取得了很多进展，但是卵巢癌发生、发展的机理及其和机体特异性抗肿瘤免疫之间的关系还有很多亟待解答的问题。exosome是由肿瘤细胞、抗原呈递细胞、上皮细胞等多种细胞分泌的囊泡小体，目前研究发现，卵巢癌患者腹水中分离获得的exosome携带有卵巢癌抗原的信息以及其他免疫效应分子，对机体特异性抗卵巢癌免疫功能可能产生重要的影响。为了进一步了解卵巢癌患者腹水来源exosome对特异性抗卵巢癌细胞免疫功能的影响及其相关机制，探索exosome的蛋白质组成，本研究进行了下列五部分实验。第一部分卵巢癌患者腹水来源exosome的分离、鉴定和定量【目的】从卵巢癌患者腹水中分离exosome，并对其进行鉴定和定量。【方法】采集41例卵巢上皮性癌患者的腹水，通过差速离心结合密度屏障超速离心的方法分离腹水中的exosome，使用透射电镜和Western Blot方法对exosome进行形态学鉴定和分子标记物鉴定。通过Bradford蛋白质定量法对exosome进行间接定量。【结果】在85.4％(35／41)的卵巢癌患者腹水中成功的分离获得exosome，但是含有杂蛋白聚合体。电镜形态学鉴定和Western Blot分子标志鉴定的符合性良好。每毫升腹水中可以获得exosome的量为(1.1±0.7)μg。【结论】从绝大多数卵巢癌患者腹水中能够分离获得典型的exosome。Bradford蛋白定量法是一种简便的exosome间接定量法，但是并非最准确的方法。第二部分卵巢癌患者腹水来源exosome刺激的淋巴细胞对卵巢癌细胞杀伤作用的研究【目的】探索卵巢癌腹水来源的exosome能否在体外环境下，改变抗原呈递细胞和淋巴细胞参与的特异性杀伤卵巢癌细胞的免疫反应。【方法】体外分离培养自体卵巢癌细胞、外周血淋巴细胞和脐血诱导分化树突细胞，将腹水中得到的exosome分别加入树突细胞和淋巴细胞的混合培养体系以及淋巴细胞单独培养体系中，7天后用经过刺激的淋巴细胞杀伤自体肿瘤细胞和卵巢癌细胞系SKOV3，改良MTT法计算淋巴细胞的抗卵巢癌细胞毒活性变化，ELISA法测定exosome刺激前后以及不同的刺激组间IFN—γ释放水平的变化。【结果】实验中成功的分离、培养了自体卵巢癌细胞和外周血淋巴细胞，从脐血中成功分离诱导获得树突细胞。树突细胞和淋巴细胞混合培养体系中加入exosome后淋巴细胞对卵巢癌细胞的杀伤率为(6.8±15.8)％，而树突细胞存在时未加exosome组的淋巴细胞对卵巢癌细胞的杀伤率为(16.0±25.9)％；exosome+淋巴细胞组和单独淋巴细胞组的杀伤率分别为(16.9±30.8)％和(16.0±22.5)％。不论靶细胞是来自白体肿瘤细胞还是SKOV3细胞系，也不论效应细胞来自卵巢癌患者外周血还是非肿瘤研究对象的外周血，上述实验结果均一致。在树突细胞和淋巴细胞混合培养体系中加入exosome后，IFN—γ的释放水平为(30.1±9.8)pg／ml；未加exosome组为(34.9±12.4)pg／ml；exosome+淋巴细胞组和单纯淋巴细胞组分别为(33.0±10.0)pg／ml和(29.2±7.1)pg／ml。将各组淋巴细胞和肿瘤细胞共同培养48小时后，IFN—γ的释放水平没有明显的变化。【结论】在树突细胞存在的条件下，exosome降低外周血淋巴细胞对卵巢癌细胞的杀伤活性。exosome对淋巴细胞释放IFN-γ的水平没有影响。第三部分卵巢癌患者腹水来源exosome对卵巢癌细胞生长和凋亡的影响【目的】探索腹水来源的exosome对卵巢癌细胞的生存是否产生影响。【方法】将腹水中获得的exosome加入卵巢癌细胞ATC和SKOV3，定时测定细胞数目的变化；annexinV—PI双染细胞后流式细胞仪测定上述细胞凋亡水平的变化，并在光学显微镜下进行验证。【结果】将来自不同剂量腹水的exosome加入卵巢癌细胞系SKOV3的培养基中，对SKOV3细胞的生长速度没有明显的影响。通过流式细胞仪检测，加入exosome后自体肿瘤细胞和SKOV3细胞的凋亡水平没有明显的变化。【结论】腹水来源exosome对卵巢癌细胞的生长和凋亡没有明显影响。第四部分卵巢癌患者腹水来源exosome对抗卵巢癌细胞免疫功能的影响【目的】初步探索卵巢癌腹水来源exosome可能影响机体抗肿瘤免疫功能的机制。【方法】将腹水中获得的exosome加入树突细胞和(或)淋巴细胞的培养体系中，annexinV—PI双染后通过流式细胞仪判断上述细胞凋亡水平的变化，并在光学显微镜下进行验证；利用流式细胞仪检测脐血中树突细胞前体细胞在加入exosome后向树突细胞诱导分化的程度是否发生改变；检测加入exosome后总淋巴细胞中CD4~+淋巴细胞和CD8~+淋巴细胞的比例是否发生改变。Western Blot法和免疫电镜技术鉴定exosome悬液中是否存在诱导凋亡信号FasL，使用抗FasL特异性抗体阻断FasL可能引起的凋亡作用，判断exosome携带的FasL在免疫细胞的凋亡中是否发生作用。Western Blot鉴定exosome悬液中是否存在Trail，DC和LC表面的Trail受体DR4和DR5通过流式细胞仪进行测定。【结果】在脐血树突细胞前体细胞的培养基中加入exosome后，3次独立实验中有一次树突细胞前体细胞的凋亡增加。在没有发生凋亡的实验中，加入exosome获得的树突细胞在光镜水平细胞形态和未加exosome组相比没有差别。如果将exosome加入到成熟树突细胞的培养基中，3次实验中有2次观察到凋亡水平增加。在诱导树突细胞分化成熟的过程中，加入exosome组CD86的表达较未加exosome组有所升高【(50.0±22.0)％和(38.6±13.3)％】，其它树突细胞的表面标志没有明显的改变。在exosome+淋巴细胞组，CD4~+T细胞／CD8~+T细胞的比值为2.4±0.85，而未加exosome的淋巴细胞组为2.0±0.4。如果加入树突细胞，那么上述两组CD4~+T细胞／CD8~+T细胞的比值分别为2.6±1.3和2.5±1.0。将exosome加入淋巴细胞培养体系后，5次实验中2次观察到淋巴细胞的凋亡增加；如果将exosome加入树突细胞和淋巴细胞的混合培养体系中，在6次实验中3次观察到淋巴细胞的凋亡增加。利用Western Blot和免疫电镜技术在exosome悬液中发现存在膜结合形式的FasL和Trail。不论树突细胞还是淋巴细胞，使用抗FasL抗体进行阻断实验时，3次独立实验中有1次能够将exosome引起的凋亡降低到未加exosome的水平。利用流式细胞术发现LC表达一定程度的Trail受体DR4，DC和LC表达低水平的Trail受体DR5，DC对DR4的表达亦极低。【结论】由于exosome携带有FasL和Trail，exosome可能诱导树突细胞前体细胞、树突细胞和淋巴细胞凋亡，并且这种诱导凋亡效应能够部分被抗FasL抗体所阻断。因为LC表达一定的比例的DR4，故exosome携带的Trail可能也参与了诱导LC凋亡的过程。所以淋巴细胞细胞毒活性的降低可能和exosome诱导其凋亡有关。exosome对肿瘤细胞的生长、树突细胞的诱导分化以及CD4~+T细胞／CD8~+T细胞的比例没有明显的影响。第五部分卵巢癌患者腹水来源exosome的蛋白质组分鉴定【目的】探索卵巢癌患者腹水来源exosome的蛋白质组成，寻找其中可能对机体免疫系统产生重要效应的组分，通过这些组分预测exosome在卵巢癌患者腹水中出现的意义和可能发挥的作用。【方法】将腹水中分离并且经过鉴定的exosome通过SDS-PAGE电泳使蛋白质组分按照分子量大小分开，判断从不同患者腹水分离得到的exosome在染色剂可分辨的水平(μg／ml)是否有差异。将exosome悬液进行双向电泳使得蛋白质成分按照分子量和等电点的差异分开。将分离的蛋白质点酶切消化后通过质谱仪进行鉴定。【结果】来自不同患者的exosome的蛋白质条带在染色剂可分辨水平下没有明显的差异。双向电泳能够提高对exosome悬液中蛋白质的分辨率。质谱仪鉴定结果显示，腹水来源的exosome悬液中丰度较高的蛋白是纤维蛋白(原)、白蛋白、免疫球蛋白、补体C3、血红蛋白亚基，其他可能性较大的蛋白有HSP70、Ⅰ型和Ⅱ型碳酸酐酶、肌动蛋白、角蛋白、锚定蛋白、α—烯醇化酶。没有鉴定出MHC分子和肿瘤相关抗原。【结论】不同患者腹水来源exoosome的蛋白质条带在常规染色水平没有明显的差异。exosome悬液中含有高丰度的纤维蛋白(原)、转运蛋白、补体、免疫球蛋白，这些蛋白可能是exosome纯化过程中伴随分离的杂蛋白，并非exosome的真正构成组分。另外含有HSP70、若干细胞骨架蛋白和酶蛋白。