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反刍动物因瘤胃代谢特点几乎不能从瘤胃中直接摄取葡萄糖,机体所需的葡萄糖有90%是通过糖异生获得。围产期的奶牛,尤其是高产奶牛,因胎儿生长和泌乳对能量的需求增加,干物质摄入量(DMI)反而降低,致使能量摄入不能满足能量需求而出现能量负平衡。为了弥补能量赤字,机体动员体脂,过度的脂肪动员就会导致能量代谢病的发生。而甘油与糖代谢关系十分密切,是动物肝内糖异生的重要前体,可有效解决反刍动物因糖供应不足而发生的能量代谢问题。近年来,甘油作为生物燃料副产品被过剩生产,使其在饲料添加剂领域得到广泛应用,然而工业甘油含有大量有害杂质(比如重金属及甲醇),对动物的生产性能和机体健康易产生不良影响,甚至通过畜产品影响到人类健康。发酵甘油则是利用某些微生物在特定条件下以糖类、淀粉或农副产品为原料进行生命活动而产生的甘油。最终的发酵混合物不含有害杂质,还省却了甘油的提取和纯化；而且富含甘油和对动物机体有益的微生物,是一种无污染、无残留的绿色饲料添加剂,在养殖业中具有广阔的应用前景。本试验以从自然界中分离的高产甘油的酿酒酵母菌(Saccharornyces cerevisiae, NAU-ZH-GY 1)为菌种,通过发酵工艺优化和连续补料发酵制备出富含甘油和酵母菌的能缓减反刍动物能量负平衡的微生物饲料添加剂,并以围产期荷斯坦奶牛为动试验对象系统地评价了富甘油酵母菌制剂对围产期奶牛生产性能、血液生化指标、酮病发生率的影响,通过对肝脏中糖异生关键酶和甘油激酶活性、mRNA和蛋白表达、以及瘤胃发酵性能及瘤胃微生物菌群变化等的研究揭示了富甘油酵母菌制剂的作用机理。为富甘油酵母菌制剂在生产上的推广应用提供理论依据和数据支持。试验1.富甘油酵母菌制剂的发酵工艺优化及制备在已有最佳发酵培养基组分的条件下,利用正交设计优化了发酵工艺条件,并通过连续补料发酵法进一步最大化甘油产量和酵母菌干重；当发酵液制成成品后,每15 d检测一次产品中甘油水平和酿酒酵母菌的活菌数,以评价富甘油酵母菌制剂的稳定性。结果显示：获得最大甘油产量的发酵条件为发酵温度为30℃、恒定pH为5和溶氧(DO)为80%,此条件下甘油浓度为38.7g/L,细胞干重为13.1g/L活菌数为9.41g CFU/ml；在发酵第24 h和48 h各补料一次,发酵72 h结束,可获得甘油浓度为75.8g/L和细胞干重为15.8g/L的富甘油酵母菌制剂；在常温下存放3个月之内,产品中甘油和活菌数均能保持较高的水平,在存放第90 d,其甘油浓度为74.5g/L,酵母菌活菌数不低于81g CFU/mL,表明该甘油制剂在常温下可以保存3个月不变质,稳定性较好。试验2.日粮中添加富甘油酵母菌制剂对围产期奶牛生产性能的影响本试验通过给围产期奶牛日粮中添加富甘油酵母菌制剂来评价其对围产期奶牛生产性能的影响。43头经产荷斯坦奶牛采用完全随机区组设计分成4个试验组：对照组(control,C)、甘油组(glycerol, G)、酵母菌组(yeast, Y)和富甘油酵母菌制剂组(glycerol-enriched yeast products, GYP),对照组奶牛饲喂基础日粮,甘油组奶牛在基础日粮上每天每头添加150 g食品级甘油(0.998g/g),酵母菌组奶牛在基础日粮上每天每头添加1L酵母培养物(含酵母干重31.1 g),富甘油酵母菌组奶牛在基础日粮上每天每头添加2L富甘油酵母菌制剂(含甘油151.6 g,酵母干重30.6g)。所有的添加剂都于晨饲时拌于饲喂总量的前1/3中,试验从产前14 d开始至产后28 d结束。于试验每日测定DMI、产后每日测定奶产量、每周进行一次乳成分测定,产犊时评价分娩系数(CC)以及于试验开始和结束测定所有受试奶牛的体重(BW)和体况评分(BCS)。试验结果显示：所有试验组奶牛的DMI、BW和BCS变化以及CC差异不显著(P>0.05)。日粮中添加甘油、酵母菌和富甘油酵母菌制剂对围产期奶牛的泌乳量和4%乳脂校正乳(FCM)无显著影响(P>0.05)；与对照组和甘油组相比,酵母菌组和富甘油酵母菌制剂组奶牛的乳脂率、乳蛋白率以及乳蛋白日产量显著提高(P<0.05)；富甘油酵母菌制剂组奶牛的乳中体细胞数(SCC)也显著降低(P<0.05),而酵母菌制剂组奶牛的乳中SCC具有一定的降低趋势(P<0.15),说明日粮中添加富甘油酵母菌制剂能显著改善奶牛的乳品质,对乳房炎具有一定的防治作用。试验3.日粮中添加富甘油酵母菌制剂对围产期奶牛血液代谢指标的影响本试验通过给围产期奶牛日粮中添加富甘油酵母菌制剂,检测奶牛的血液生化指标以及酮病的发生率来评价该制剂对围产期奶牛能量状态以及酮病发病率的影响。试验设计同试验2,试验从产前14d开始至产后28 d结束。于分娩第-14、-7、-1、7、14、21和28 d晨饲后3h,采集尾静脉血液测定血液中的生化指标,以血液中β-羟丁酸(BHBA)浓度为1.0 mmol/L和2.6 mmo/L作为亚临床型酮病和临床型酮病的判定标准。试验结果显示：日粮中添加甘油、酵母菌和富甘油酵母菌制剂对血浆中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、总胆红素(TBiL)、直接胆红素(DBiL)、肌酐(Crea)和丙氨酸转氨酶(ALT)的浓度无显著影响(P>0.05),但添加酵母菌和富甘油酵母菌制剂能显著升高血浆钙(Ca)和总蛋白(TP)浓度(P<0.05),对血浆磷(P)浓度具有一定的升高趋势(P=0.10),而对血浆尿素(Urea)和天冬氨酸转氨酶(AST)浓度具有一定的降低趋势(P=0.07,P=0.10)。与对照组和酵母菌组相比,甘油组和富甘油酵母菌制剂组奶牛的血糖水平显著升高(P<0.05),血浆BHBA和非酯化脂肪酸(NEFA)水平显著降低(P<0.05)；其临床型酮病和亚临床型酮病的发病率也明显低于对照组,说明富甘油酵母菌制剂能充分发挥甘油作为生糖前体的作用,能显著改善围产期奶牛的能量平衡状态和降低酮病发生率。试验4.日粮中添加富甘油酵母菌制剂对围产期奶牛肝脏内糖异生关键酶及甘油激酶的影响本试验通过给围产期奶牛日粮中添加富甘油酵母菌制剂,检测奶牛产后第14d肝脏内丙酮酸羧化酶(PC)和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)以及甘油激酶(GK)的酶活性、mRNA和蛋白表达来揭示该制剂对围产期奶牛葡萄糖异生作用的调节机理。试验设计同试验2,试验从产前14d开始至产后28 d结束。于分娩后第14 d从各试验组中随机选取5头奶牛,肝脏活体穿刺采集其肝脏组织,应用分光光度法、Real-time PCR和Western blot分别检测组织中PC、PEPCK和GK的酶活性、mRNA和蛋白表达水平。结果显示：与对照组相比,富甘油酵母菌制剂组奶牛产后第14 d肝脏内PEPCK的活性以及胞浆型PEPCK (PEPCK-C)的mRNA和蛋白表达水平均显著升高(P<0.05)；GK的活性显著升高(P<0.05),其mRNA表达水平有升高趋势(P=0.088)；但PC的活性、mRNA和蛋白表达水平无明显差异(P>0.05)。结果说明日粮中添加富甘油酵母菌制剂通过上调PEPCK的酶活性以及PEPCK-C的mRNA和蛋白表达水平、以及上调GK的酶活性和mRNA表达水平来促进葡萄糖异生而升高奶牛血糖水平,从而改善奶牛的能量平衡状态。试验5.日粮添加富甘油酵母菌制剂对围产期奶牛瘤胃的发酵性能及微生物菌群结构的影响本试验通过给围产期奶牛日粮中添加富甘油酵母菌制剂,检测奶牛产前产后第14 d瘤胃内发酵参数变化和瘤胃微生物菌群变化来揭示该制剂对围产期奶牛瘤胃发酵特性和内环境的调控机理。试验设计同试验2,试验从产前14 d开始至产后28 d结束。于分娩前后第14d采集所有受试奶牛的瘤胃液,测定瘤胃液中的发酵参数和提取瘤胃液的总DNA,利用细菌通用引物27F/342R扩增16S rDNA的基因序列,用Hha I酶对克隆片段进行限制性酶切,产物进行限制性片段长度多态性(RFLP)分析、聚类,对瘤胃中主要细菌进行16S rDNA基因序列克隆,运用Real-time PCR技术对目标细菌进行定量分析。结果显示：日粮中添加甘油、酵母菌和富甘油酵母菌制剂对围产期奶牛产后瘤胃内pH、乙酸和丁酸摩尔百分比影响差异不显著(P>0.05)。与对照组相比,甘油组、酵母菌组和富甘油酵母菌制剂组奶牛产后瘤胃内挥发性脂肪酸(VFA)和丙酸摩尔百分比显著性升高(P<0.05),而乙酸丙酸比例显著性降低(P<0.05),氨氮浓度有降低的趋势(P=0.08),说明日粮中添加富甘油酵母菌制剂能显著改善围产期奶牛的瘤胃发酵性能,改善瘤胃发酵模式。相对于产前,在产后厚壁菌门细菌显著升高(P<0.05),而变形菌门细菌显著降低(P<0.05)；其中甘油组、酵母菌组和富甘油酵母菌制剂组奶牛瘤胃内厚壁菌门细菌在产后显著高于对照组(P<0.05),而变形菌门、拟杆菌门和软壁菌门在各试验组之间差异不显著(P>0.05)。与对照组相比,富甘油酵母菌制剂组奶牛产后瘤胃中乳酸生成菌牛链球菌以及乳酸降解菌反刍月形单胞菌和埃氏巨型球菌的数量显著升高(P<0.05),而甘油组和酵母菌组奶牛瘤胃内反刍月形单胞菌和埃氏巨型球菌的数量也显著升高(P<0.05),但牛链球菌数量升高不显著(P<0.15),说明日粮中添加富甘油酵母菌制剂能显著改善围产期奶牛瘤胃内的微生物区系,能显著提高利于丙酸生成的细菌数量而提高丙酸产量,进而提高葡萄糖异生前体浓度,从而改善围产期奶牛的能量平衡状态。