荧光蛋白是现代生物学研究中的重要标记工具之一。科学家们基于已有发色团结构及荧光蛋白发光机理,已经获得了许多光学性质优良的荧光蛋白。就深层组织成像而言,所使用的荧光蛋白需要具有良好的单体性质,较高量子产率、较快的成熟时间,其荧光光谱应该更加靠近650 nm至1100 nm的“近红外光学窗口”。然而,目前尚无同时满足这些要求的近红外荧光蛋白。为了能够更加理性的进化出性能优良的近红外荧光蛋白,我们仍需要聚焦荧光蛋白的发色团结构及其微环境。拉曼光谱是分子振动、转动状态的“指纹图谱”,生物大分子的拉曼光谱可以反应诸多分子结构信息。为此,本文深入研究了EGFP系列荧光蛋白（EGFP、ECFP、EYFP）和mNeptune及其突变体的拉曼光谱,创新性地将荧光蛋白的特征拉曼谱峰、发色团结构特征及其光学性质之间建立了关联,提出了影响荧光蛋白发射波长发生位移的可能性机制,具体如下:1.获得EGFP系列荧光蛋白的拉曼光谱,观察到C=N₁谱峰变化,这是因为EGFP和ECFP的N₁与H2O形成氢键,并且N₁通过该氢键从H₂O吸电子,相比于不存在该氢键作用的EYFP,这种吸电子效应造成C=N₁谱峰红移。而EGFP中该氢键作用比ECFP更强,其具有更强的吸电子效应,因此,EGFP的C=N₁谱峰相比于ECFP更加红移。2.EGFP系列荧光蛋白的拉曼光谱中,发现C₅=C₆谱峰位置与其最大吸收波长之间存在良好的直线关系,表明C₅=C₆的拉曼位移与荧光蛋白激发能之间存在激发能越小,C₅=C₆拉曼谱峰红移的现象。同样的,在mNeptune系列红色荧光蛋白中也发现类似现象,该现象产生的原因还需要进一步进行科学合理地解释。3.获得mNeptune系列红色荧光蛋白的拉曼光谱,发现mNeptune684的66Tyr苯酚环相关的拉曼谱峰变化的现象,相比于mNeptune,1170、1400蓝移到1176、1416 cm^-1,1156 cm^-1由于蓝移被1176 cm^-1覆盖。这是因为在mNeptune684中,158N和143N形成协同的氢键作用,通过该作用对C₁₂-O₁₄及66Tyr的苯环产生吸电子效应,降低了66Tyr苯酚环的电子密度,造成其相关的拉曼谱峰同时发生蓝移。这是158N和143N协同的氢键作用对mNeptune系列荧光蛋白拉曼光谱产生改变的最直接的证据之一。基于此,预计在未来的近红外荧光蛋白往光谱更加红移的方向进化时,采用类似的方法产生更多协同的氢键作用,进一步拓展发色团的共轭平面。本研究不仅为荧光蛋白发色机理、波长红移等光学性质的阐释提供了重要理论依据,同时为荧光蛋白的体外进化提供了指导性的结构信息。此外,本研究进一步拓展了拉曼光谱在生物大分子结构研究中的应用。