论文部分内容阅读
作为优良的生物液体燃料,以木质纤维素类生物质为原料的生物丁醇生产技术受到了广泛关注和研究。然而,酶制剂使用量大、木糖发酵性能差、丁醇比产率低和发酵副产物多等不足,严重制约了传统生物丁醇发酵技术的推广应用。以开发更加经济高效的生物丁醇生产技术为目标,本文提出了木质纤维素丁酸-丁醇分步发酵的技术思想,并在充分论证的基础上,开展了水稻秸秆丁酸发酵菌群的构建与发酵条件优化、秸秆糖化液和丁酸发酵液组分对丁醇发酵的影响与机制、秸秆丁酸-丁醇分步发酵系统的构建与效能评估等研究,以期为开发更加经济高效的生物丁醇生产技术提高理论与技术支撑。以有效提高水稻秸秆的降解和转化率,基于不同菌种之间的代谢互补性,本文首先通过生物强化和菌种复配技术分别构建了中温和高温发酵混合菌群,用于发酵水稻秸秆生产丁酸,为后续丁醇发酵提供原料。结果表明,利用丁酸发酵菌Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755对前期获得的秸秆丁酸发酵菌群DCB进行生物强化,可显著提高丁酸发酵菌ClostridiumⅣ簇的丰度,以及参与碳水化合物转运和代谢、能量产生的功能基因拷贝数,使菌群发酵秸秆的丁酸产量由5.53 g/L大幅提升到了18.05 g/L。而由高温纤维素降解菌C.thermocellum ATCC 27405和高温丁酸发酵菌C.thermobutyricum ATCC 49875构建的秸秆丁酸发酵菌群TDCB,在优化条件下,其发酵秸秆的丁酸产量可高达33.14 g/L。分析表明,在高温丁酸发酵菌群中,菌株ATCC 27405可高效水解秸秆并产生大量可发酵糖,而菌株ATCC 49875的丁酸发酵能力更强,并可解除糖积累对纤维素和半纤维素水解过程的抑制作用。研究发现,菌株ATCC 49875可通过次级代谢将发酵产物乳酸、乙酸和乙醇等转化为丁酸,进一步提高了丁酸发酵效能。为验证水稻秸秆丁酸-丁醇分步发酵技术的可行性,以丁醇发酵细菌C.beijerinckii NCIMB 8052为发酵菌种,分别考察了丁酸与水稻秸秆水解糖化产物主要组分为共底物的丁醇发酵特征,以及秸秆丁酸发酵副产物对丁醇发酵的影响。结果表明,菌株NCIMB 8052可发酵葡萄糖、木糖、纤维二糖产丁醇,但产量均较低,发酵木糖的产丁醇能力最差。当添加3 g/L丁酸作为共底物后,菌株NCIMB 8052发酵葡萄糖、木糖和纤维二糖的产丁醇能力大幅增加,产量提高了1.53~9.91倍。当丁酸浓度为5 g/L、接种细胞浓度为0.59 g/L时,丁醇产量高达11.89 g/L。以0~1.5 g/L为共底物时,虽然不会影响丁醇的最终产量,但会显著降低丁酸的吸收与转化速率。以挥发性脂肪酸(VFAs)混合物为共底物的丁醇发酵实验表明,较高浓度的VFAs,对菌株NCIMB 8052的细胞生长和丁醇产生均有严重的抑制作用,但在较低浓度时无显著影响,丁醇产量可以达到12.14 g/L。关键酶基因的转录水平分析表明,丁酸的吸收和转化可能是通过合成丁酸的逆反应实现的,而不是由Co A转移酶催化完成的。添加适宜浓度的VFAs,可以有效促进编码醇脱氢酶的adh E基因的转录,进一步证明了水稻秸秆丁酸-丁醇分步发酵技术的可行性与有效性。在上述研究基础上,形成了两个水稻秸秆丁酸-丁醇分步发酵系统,即以水稻秸秆糖化液和中温丁酸发酵液为共底物的丁醇发酵系统(FMP),以及以水稻秸秆糖化液和高温丁酸发酵液为共底物的丁醇发酵系统(FTP),并对其丁醇发酵效能进行了综合比较分析。结果表明,FMP和FTP系统的丁醇产量分别高达12.85和15.86 g/L,均显著高于仅以秸秆糖化液为底物的丁醇发酵系统(FSP)的6.27 g/L。关键酶的转录水平分析表明,FMP和FTP系统中编码催化丁酸吸收转化以及丁醇合成的酶基因的转录水平,均显著高于FSP系统,从酶基因转录水平阐释了丁酸-丁醇分步高效发酵的机制。与已报道的木质纤维素丁醇发酵研究成果相比,FMP和FTP系统在丁醇和能量产率方面均具有较明显的优势,其水稻秸秆的丁醇比产率分别达到108.5和149.4 g/kg,能量比产率分别达到4418.3和6043.7 k J/kg。由于纤维素酶制剂的使用量仅为传统糖化-发酵工艺的1/3左右,秸秆丁酸-丁醇分步发酵技术具有更好的经济性。