论文部分内容阅读
目的(1)研究Hsp104是不是可以阻止异常朊蛋白的聚集或者对异常朊蛋白的聚集具有解聚作用,为研究PrPsc聚集体或单体对神经细胞是具有保护作用还是毒性作用具有一定的意义;(2)根据PrP106-126肽具有聚集成纤维的特点,将其作为PrPsc聚集的模式,拟通过Hsp104干扰PrP106-126纤维形成,来探讨PrPsc聚集形成的机制。方法(1)利用原核表达系统表达全长Hsp104蛋白;(2)PrP106-126肽用缓冲液溶解,然后把样品分成两组,一组加Hsp104蛋白5μM,另一组未加Hsp104蛋白。每组各6个样品,370C,分别孵育Oh、12h、24h、48h、72h和96h;(3)采用荧光光谱法(ThT分析法)、透射电子显微镜、原子力显微镜、圆二色谱法和MTT比色法对样品进行检测。结果利用原核表达系统成功表达了全长Hsp104蛋白;在体外实验过程中证实PrP106-126可以形成纤维,而且随着孵育时间的延长,纤维越来越细,相互交织形成网状结构。PrP106-126肽在不同的细胞(如HeLa细胞和SK细胞)中具有相似的毒性。而且也发现PrP106-126肽聚集成纤维后比PrP106-126肽对细胞的毒性要低。当Hsp104存在时PrP106-126肽可以保持其对细胞的毒性。并且能够明显的抑制PrP106-126纤维的形成,同时其解聚作用也很明显。其作用机制是通过改变PrP106-126肽的二级结构从p-折叠结构转变成无规卷曲,而使已经聚集形成的纤维发生解聚,从而可以拮抗PrP106-126肽纤维聚集的形成来阻止淀粉样转变。从而保持PrP106-126肽对细胞的毒性。结论利用原核表达系统成功表达全长热休克蛋白Hsp104蛋白;从动力学、形态学、二级结构三方面证实热休克蛋白Hsp104在体外可抑制PrP106-126肽聚集形成纤维;体外细胞毒性实验证实热休克蛋白Hsp104能够抑制PrP106-126肽聚集形成纤维,还可维持PrP106-126肽的细胞毒性作用;体外动力学实验证实热休克蛋白Hsp104对PrP106-126肽形成的纤维具有解聚作用;体外细胞毒性实验证实热休克蛋白Hsp104能够使PrP106-126肽聚集形成的纤维解聚成PrP106-126肽或低聚物,诱导细胞毒性作用。