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用破骨细胞分化因子RANKL(50ng/ml,72h)诱导小鼠单核/巨噬细胞系RAW264.7生成的破骨细胞均一性好,无杂质细胞,具有典型的形态学特征和功能特性:胞体大、边缘不整齐,多核、有伪足和丝状突起,胞质内可见大小不等的空泡,核在细胞内分布无规律;抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性并具有在骨磨片上形成骨陷窝的破骨活性。RANKL诱导过程中RAW264.7细胞的生长曲线可以看出1d～2d为分化阶段,没有细胞增殖;2d～3d为分化增殖阶段,破骨细胞分化成熟并增殖;3d～5d为破骨细胞指数增殖阶段;5d～9d为破骨细胞凋亡阶段。将不同浓度的待检物质与诱导剂一并加入RAW264.7及其培养液中,于第5天进行MTT检测,从而确定每种物质的最适作用浓度,并通过诱导曲线研究每种物质在最适作用浓度下对破骨前体细胞分化成熟以及对破骨细胞增殖和凋亡的影响。结果表明在破骨细胞的诱导曲线中,添加了 17β-雌二醇(10μg/ml)和大豆异黄酮(100μg/ml)的细胞分别在第3～7d、第3～6d的A490值与未添加组相比差异显著(P<0.05),说明二者能显著抑制破骨前体细胞向破骨细胞分化和破骨细胞的增殖,并能显著促进破骨细胞的凋亡。降钙素(830ng/ml)能显著抑制分化和增殖,甲状旁腺素(100μg/ml)则显著抑制增殖。羊骨胶原肽及肽钙螯合物(高钙和低钙)的最适作用浓度均为100 μg/ml,、羊骨髓肽及肽钙螯合物(高钙和低钙)的最适作用浓度均为1000 μ g/ml,对分化表现出一定的抑制作用,但效果不显著,但可显著抑制破骨细胞的增殖,在第4、第5天的A490值显著低于未添加组(P<0.05)。未经水解的骨胶原和阴性对照BSA一样,对破骨细胞的分化、增殖和凋亡没有影响。离子钙则对破骨细胞的增殖则表现出显著抑制作用。对加入RANKL和最适浓度受试物的RAW264.7细胞培养5天,检测细胞裂解液中的抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)的活性,结果表明与空白对照组相比,17β-雌二醇、大豆异黄酮、降钙素对破骨细胞TRAP活性的抑制作用极显著(p<0.01),甲状旁腺素的抑制作用显著(p<0.05)。各受试物对破骨细胞的抗酒石酸酸性磷酸酶活力都有一定的抑制作用,其中含钙量低的肽钙螯合物即羊骨骨髓肽钙螯合物(钙低)和羊骨胶原肽钙螯合物(钙低)对TRAP活性的抑制作用极显著(p<0.01)。含钙量高的羊骨骨髓肽钙螯合物(钙高)和羊骨胶原肽钙螯合物(钙高)对TRAP活性显著低于空白对照组(p<0.05)。骨胶原短肽、骨髓肽、胶原蛋白、BSA、CaC12添加组与空白对照组相比差异则不显著。可见只有肽钙螯合物可显著抑制破骨细胞的TRAP活性,即显著抑制破骨细胞的骨吸收功能,且低钙组的抑制活性高于高钙组。对骨吸收活性抑制作用最强的低钙肽钙螯合物加入破骨细胞中与骨磨片共培养,结果表明低钙羊骨骨髓肽钙螯合物(103μg/ml)和低钙羊骨胶原肽钙螯合物(102μg/ml)添加组形成的骨吸收陷窝数分别为34±3.65个和32.5±3.69个,和17β-雌二醇添加组(28.5±2.21个)一样,极显著低于空白对照组的43±3.41个(P<0.01)。可见,羊骨胶原肽钙螯合物以及骨髓肽钙螯合物作用于体外培养的破骨细胞,其作用类似于17β-雌二醇、大豆异黄酮、降钙素和甲状旁腺素,可显著抑制破骨细胞的增殖和骨吸收活性,并且低钙含量的肽钙螯合物的TRAP活性抑制作用由于高钙含量肽钙螯合物的抑制作用。四种激素中,17β-雌二醇、大豆异黄酮、降钙素还具有抑制破骨细胞分化的作用,17 β-雌二醇和大豆异黄酮还具有促进破骨细胞凋亡的作用。