帕金森病是中老年人常见的慢性进展性的神经系统退行性疾病,主要病理变化为中脑黑质的多巴胺能神经元变性和坏死,致黑质纹状体的多巴胺能通路受损,最终导致体内多巴胺含量降低,从而引起静止性震颤、肌强直和姿势步态异常等临床表现。目前尚未彻底明确其病因及发病机制,可能与遗传、环境、氧化应激、免疫炎症、细胞凋亡等多因素有关。目前临床上尚无有效的治愈手段,药物治疗仅能改善临床症状,并且需要维持治疗,但长期用药后存在药效衰减及并发症增多等弊端。目前认为细胞移植可作为治愈帕金森病的潜在方法。本研究首先研究人脐血间充质干细胞(human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)在体外向神经细胞分化的可能性,再将其移植入PD模型大鼠脑内,应用免疫组化及免疫荧光方法观察移植的hUC-MSCs在脑中的分布,并探讨hUC-MSCs移植治疗帕金森病的机制与效果,为临床应用提供基础。第一部分脐血间充质干细胞的培养和鉴定目的:研究hUC-MSCs的生物学特性,探讨在体外向神经细胞诱导分化的可能性。方法:从脐血中提取hUC-MSCs进行培养及诱导分化。培养基中添加表皮生长因子EGF、碱性成纤维细胞生长因子BFGF、胶质细胞系源性神经营养因子GDNF、脑源性神经营养因子BDNF、全反式维甲酸RA,进行诱导分化。用相差显微镜观察hUC-MSCs的形态特征,流式细胞仪检测hUC-MSCs表面标志的表达,免疫组织化学法检测神经细胞标志的表达。结果:hUC-MSCs传代培养后,细胞呈漩涡状生长。hUC-MSCs表面标志用流式细胞仪检测提示CD44、CD90、CD29、CD105的表达较强,CD45、CD34及HLA-DR均不表达,其中CD45代表白细胞表面标志,后两种代表造血前体细胞表面标志。免疫组化染色Nestin、NSE、GFAP染色均为阳性。TH染色为阴性,BrdU染色呈阳性。结论:hUC-MSCs可向神经细胞分化,具有神经细胞表面标志。第二部分晚期帕金森病大鼠模型的建立目的:制作稳定的晚期帕金森病(PD)大鼠模型方法:利用脑立体定向仪,将6-羟基多巴胺注入大鼠内侧前脑束及右侧中脑腹侧被盖区。用阿朴吗啡诱导旋转行为,取大鼠黑质进行免疫组织化学染色检测多巴胺能神经元TH表达。结果:PD大鼠黑质进行免疫组织化学染色,损毁侧黑质中的TH阳性神经元损失达对侧90%以上。结论:通过6-OHDA注射可成功制作单侧完全性损伤PD大鼠模型。第三部分hUC-MSCs移植治疗晚期PD大鼠的实验研究目的:探讨hUC-MSCs移植对PD大鼠的治疗作用。方法:将大鼠随机分为hUC-MSCs移植治疗组(25只大鼠)和生理盐水对照组(21只大鼠),观察hUC-MSCs移植后PD大鼠的行为学改变。术后1周,制备大鼠脑冰冻切片,进行免疫荧光化学染色检测移植细胞hUC-MSCs的TH表达情况。移植术后2周和8周,分别对两组大鼠纹状体进行免疫组织化学染色检测TH阳性细胞数存活率。移植术后8周对损毁侧纹状体进行DA含量测定。结果:移植术后1周对移植的纹状体区进行免疫荧光化学染色,显示BrdU标记的TH阳性细胞率为80%±34%。移植术后2周和8周,分别对两组大鼠纹状体进行免疫组织化学染色,发现移植组TH阳性细胞数明显增多,移植术后8周对损毁侧纹状体进行DA含量测定,hUC-MSCs移植组中DA含量为1754.12±14.79 pg/g,生理盐水对照组为1687.94±14.82pg/g。结论:将hUC-MSCs移植到大鼠PD模型中,可改善PD大鼠旋转行为,并且表达TH蛋白。