论文部分内容阅读
LysR家族调节蛋白是一类广泛存在于α-朊细菌各属中的转录调控因子。它参与调节细菌的新陈代谢、细胞分裂、群体感应、毒力、运动性、固氮和抗氧化反应等生命活动。苜蓿中华根瘤菌Rm1021共有98个LysR家族转录因子基因,研究组前期通过插入突变筛选到一个影响紫花苜蓿结瘤固氮的关键基因lsrB。为排除插入突变体可能存在极性效应,我们成功构建了苜蓿中华根瘤菌lsrB缺失突变体,通过研究发现,LsrB不但参与脂多糖的生物合成的调节,还影响与宿主植物的共生固氮能力。将lsrB缺失突变体接种宿主植物发现,lsrB缺失突变体与插入突变体具有相同的共生表型,它能诱导紫花苜蓿形成无效根瘤;突变体根瘤中出现类菌体分化异常,共生体膜分离以及类菌体降解等根瘤衰老的特征。lsrB突变导致根瘤菌细胞处于内源氧化状态,而且在lsrB缺失突变体诱导的根瘤中积累了大量的活性氧簇基团(ROS)。这些结果表明,LsrB可能是根瘤菌中的新的氧化感受调节蛋白。 许多氧化胁迫感受蛋白(如OxyR)主要通过半胱氨酸巯基的氧化还原来感受环境中的氧化信号,从而调节下游基因的表达。对lsrB基因的同源性分析发现,该基因存在于所有的根瘤菌和一些植物(动物)病原细菌中,其编码蛋白的底物结合结构域上存在较为保守的半胱氨酸残基。因此,我们推测LsrB可能通过半胱氨酸残基(Cys)的氧化和还原,改变自身构象,从而调节下游基因表达。为验证该假设,我们以苜蓿中华根瘤菌Rm1021为研究材料,将LsrB上的3个Cys残基(C146、C238和C275)分别置换为Ser,获得了苜蓿中华根瘤菌lsrB单点突变体(C146S、C238S和C275S)、两点突变体(C146/238S、C146/275S和C238/C275S)和三点突变体3m,然后进行遗传表型分析。将这些lsrB定点突变体接种紫花苜蓿,四周后观察发现,接种3m的植株显示缺氮症状(矮小、发黄),与接种lsrB缺失突变体的植株相似。而接种单点突变体,两点突变体的植株从外观上看与接种野生型根瘤菌的植物相似,但生物量明显减少。该结果表明,LsrB在共生固氮过程中的调节作用主要是通过蛋白质上的Cys残基来实现的。重要的是,lsrB缺失突变体和三点突变体3m对氧化剂非常敏感。lsrB和其下游基因lrp3以及与氧化胁迫反应相关的基因(如katA和gshA)均受氧化剂诱导表达,但Cys突变显著降低了氧化剂对相关基因的诱导表达水平。该结果表明,LsrB蛋白上的三个Cys残基是其诱导下游基因表达所必须的,其中C238是主要的调节位点。 在氧化条件下,LsrB蛋白上的两个Cys残基可能被氧化形成分子间二硫键,从而形成二聚体和多聚体。免疫沉淀实验进一步表明,LsrB是以二聚体的形式存在苜蓿中华根瘤菌中,而三点突变蛋白则难以形成二聚体。凝胶阻滞(EMSA)实验表明,氧化条件可以促进LsrB与lrp3启动子上的TN11A模体(motif)结合,而LsrB半胱氨酸残基突变蛋白则与含有该位点的DNA片段组成性结合。最后,转录组数据(RNA-seq)揭示,LsrB是一个全局性的转录调节因子,参与根瘤菌的许多生理代谢活动。综合现有的研究结果,我们确定LsrB是根瘤菌在共生条件下感受氧化胁迫的关键调节蛋白,它是共生体系稳定存在的必需分子开关。