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目的邻苯二甲酸酯(phthalic acid esters,PAEs)是工业上常用的塑化剂,广泛地存在于我们日常生活的各种商品中。PAEs会对机体的内分泌系统、心、肝、肺、肾及生殖系统等多种组织系统产生慢性毒性作用,存在一定的危险性。邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(di(2-ethylhexyl)phthalate,DEHP)是 PAEs 中使用最为广泛的一种化合物,而邻苯二甲酸单乙基己基酯(mono(2-ethylhexyl)phthalate,MEHP)是DEHP在机体内的代谢活化产物,其毒性较DEHP更强。胚胎干细胞(Embryonic Stem Cell,ESC)是一种能够无限增殖、自我更新、可分化为机体各种细胞的多能性细胞,因其对受试物有较好的灵敏性,是近年来常用的体外替代实验对象。为了探究MEHP的毒性作用,本研究就MEHP对小鼠胚胎干细胞的多能性维持的影响及其可能的机制进行研究,进而为胚胎早期发育的影响因素及相关机制的研究提供理论依据。方法1.细胞培养:用小鼠胚胎成纤维细胞(辐照后)(Mouse Embryonic Fibroblast,MEF)支持培养小鼠胚胎干细胞(mouse Embryonic Stem Cell,mESC),于 37℃、5%CO2的培养箱中培养,隔天换液,5～7天可传代一次。用碱性磷酸酶染色法检测mESCs是否分化,被染成蓝紫色的mESCs表示细胞未出现分化,说明该批次细胞可用于后续实验。2.受试物的配制:称取MEHP溶于DMSO中,滤菌后,用mESCs培养液配制含0.1%DMSO的对照溶剂组及0.1、1、10、100、1000μmol/LMEHP的不同染毒剂量组。3.mESCs细胞形态观察:用含有不同浓度受试物的培养液培养细胞,在镜下观察MEHP对mESCs细胞形态的影响。4.细胞毒性检测:用含有不同浓度受试物的培养液培养细胞,将MEHP处理后的细胞进行细胞活力检测(CCK8法)和细胞凋亡检测(流式细胞术),分析MEHP对mESCs的细胞毒性。5.碱性酸酶活性检测:将MEHP处理后的细胞用碱性磷酸酶染色液进行染色,分析MEHP对mESCs多能性维持的影响。6.基因表达水平检测:将MEHP处理后的细胞,提取总RNA后,反转录生成cDNA,以Real-time PCR法检测多能性维持标记物SOX 2、OCT 4基因表达水平的变化。7.蛋白表达水平检测:将MEHP处理后的细胞分别用免疫荧光法和Western-blot法检测SOX 2、OCT 4蛋白表达水平的变化。结果1.细胞形态观察发现,随着染毒剂量的增加,mESCs的克隆细胞团的数量出现降低,细胞团的大小也有减少,在高剂量组(1OOOμmol/L)中效果尤为明显。2.细胞活力检测发现,高剂量组(1000μmol/L)的mESCs细胞活力显著降低(P<0.05),其它剂量的细胞活力也出现降低趋势,但效果不显著。3.细胞凋亡检测发现,高剂量(1OO0μmol/L)MEHP可增加mESCs总细胞凋亡率(P<0.05),其他剂量组随着染毒剂量的增加,凋亡率呈增加趋势,但与对照组比较效果并不显著(P>0.05);而对于其他的细胞凋亡指标,如活细胞比率、早期细胞凋亡率、晚期细胞凋亡率、细胞碎片比率,各剂量组间均未出现显著性差异(P>0.05)。4.碱性磷酸酶染色发现,对照组和低剂量组的mESCs均被染成深蓝色或蓝紫色,而高剂量(1000μmol/L)的mESCs着色较浅,甚至未着色。5.对mESCs全能性标记物SOX 2、OCT 4进行基因蛋白检测发现,在100μmol/L、100μmol/L剂量组中,SOX 2、OCT 4基因表达均出现显著降低(P<0.05)。6.蛋白检测结果发现,SOX2、OCT4蛋白结果与基因结果相似,发现SOX 2和OCT 4蛋白表达在100μmol/L时其表达量出现降低,但不显著,而在1000μmol/L剂量时其表达量出现了显著降低(P<0.05)。结论1.MEHP能够影响mESCs的形态,降低mESCs的细胞活力,并增加总的细胞凋亡率,因此,一定剂量的MEHP对mESCs存在细胞毒作用,能够抑制mESCs的正常生长。2.MEHP能够减少了碱性磷酸酶的合成降低mESCs多能性标记物SOX 2和OCT4的基因和蛋白表达水平,影响mESCs的多能性维持,致使其向着非正常的方向分化,进而影响到胚胎早期发育。