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背景:
子宫内膜异位症（endometriosis，EMT）是指子宫内膜组织（包括腺体和间质）出现在子宫体以外的部位，最常见的发病部位包括宫骶韧带、卵巢，其次为子宫及其他脏腹膜、阴道直肠隔等部位。关于子宫内膜异位症发生、发展的机制至今尚未完全明确，最经典的学说是以经血逆流为主导的Sampson种植学说，另外可能的机制包括免疫系统异常、体腔上皮化生学说、不良生活方式影响、环境对机体的影响等，以及近期的热点方向如表观遗传学异常等。这些因素中有可能某几个或全部联合发挥作用，或者由于潜在生物学途径的特定的亚型疾病而引起病变。
EMT的治疗方式主要有手术治疗和药物治疗，手术后或停药后均存在复发的问题，且手术治疗在一定程度上可破坏卵巢功能，手术后仍存在较高的复发率。药物治疗是以抑制卵巢功能为目的，并可引起一系列的围绝经期症状，以及肥胖、痤疮和多毛等不良反应。因此，欲彻底治疗EMT则需从其发病机制入手，研究一种疗效显著且副作用较少的药物，是如今我们迫切需要解决的问题。
在引起EMT的机制学说中，表观遗传学异常学说在近年来逐渐得到人们的关注。表观遗传的现象很多，已知的有DNA甲基化（DNAmethylation），基因组印记（genomicimprinting），母体效应（maternaleffects），基因沉默（genesilencing），核仁显性，休眠转座子激活和RNA编辑（RNAediting）等。DNA异常甲基化是表观遗传学异常的现象之一。DNA异常甲基化有可能参与了EMT的发生发展，EMT中的基因表达异常可能与激素和环境因素息息相关。越来越多的证据表明，EMT的发生有一部分原因是由于表观遗传异常引起的。E-cad作为一种位于上皮细胞的细胞膜表面的跨膜糖蛋白，其功能是作为细胞与细胞之间的粘合剂，参与维持上皮细胞的极性和完整性。E-cad基因(CDH1)参与调节细胞分化及生物学行为的多种过程，包括细胞极化、细胞迁移和癌灶转移。越来越多证据显示，E-cad表达的下调与上皮性细胞的迁移及上皮性肿瘤的扩散有关。而CDH1的高甲基化可能会引起E-cad的表达异常，从而影响参与上皮性肿瘤的转移。CDH1的异常甲基化状态不仅与上皮性肿瘤的转移有关，有可能与EMT也有关。研究表明，在EMT患者中，其E-cad基因启动子区CpG岛呈现出高甲基化状态。E-cad基因的高甲基化可能与子宫内膜异位症中DNMT家族、雌激素和孕激素受体基因、芳香化酶家族的异常表达相关。这其中的一种或几种因素共同作用可能是导致子宫内膜异位症发病的重要原因。
EGCG是绿茶的提取物，除了众所周知的抗氧化作用以外，它最早在1987年被证实具有抗肿瘤作用。EGCG的抗癌作用已被发现有多种分子机制，包括抑制与EGFR结合的配体结合；抑制尿激酶、蛋白激酶C、脂氧合酶和环氧化酶活性；诱导肿瘤细胞凋亡坏死及引起肿瘤细胞周期的停滞等。此外，EGCG也能抑制DNMT表达，并能将多瘤抑制基因、p53基因等抑癌基因的高甲基化状态逆转。有学者报道，在具有与恶性肿瘤生物行为学相似的良性疾病——子宫内膜异位症中，EGCG也同样发挥一定的作用。EGCG及其前体能改变子宫内膜异位症中某些基因的甲基化状态，使其转录的蛋白表达增加，使异位病灶显著地缩小，抑制病灶内功能性和机构性的微血管，从而使病灶加速凋亡。
前期研究表明，E-cad启动子区甲基化状态异常在子宫内膜异位症发生、发展的机制中具有一定影响作用。
本课题利用慢病毒载体介导红色荧光蛋白和荧光素酶基因于体外成功转染人的子宫内膜组织后，通过腹腔注射种植内膜组织，成功构建可示踪的内异症裸鼠模型，在不同的药物干预下，利用活体成像仪实时动态监测异位病灶的变化情况。采用免疫组化及焦磷酸测序等生物学技术，探究上皮型钙黏蛋白在细胞膜表面的分布情况及E-cad基因启动子区CpG岛上DNA甲基化状态，进一步探索EGCG对EMT的治疗功效及其可能的作用机制。
目的：
1.EGCG能否改变E-cad在异位细胞的细胞膜表面的分布情况。
2.在子宫内膜异位症中，EGCG能否改变异位的内膜细胞E-cad启动子区CpG岛上的DNA甲基化状态。
3.评价EGCG对动物模型中子宫内膜异位病灶的作用价值。
方法：
根据前期实验，人子宫内膜异位症可示踪的裸鼠模型已成功建立。将上述裸鼠模型随机分为三组，分别为A组（EGCG组）、B组（地西他滨组）和C组（注射用水组）。每2天一次将等体积分数的EGCG、地西他滨和注射用水腹腔注射到每组裸鼠体内。自腹腔种植内膜组织后第一天起，用活体成像仪每4天一次监测异位病灶的生长情况。16天后，颈椎脱臼法处死裸鼠并分离病灶，通过免疫组化法测定种植前、种植后各组E-cad在细胞膜表面的分布情况，以及通过焦磷酸测序法检测种植前、种植后各组E-cad基因启动子区CpG岛的DNA甲基化状态。
结果：
1.A组和B组的异位病灶的荧光信号ROI值在第1天至第8天逐渐增长（P＜0.01），在第8天至第16天之间逐渐缩小（P＜0.01)。C组异位病灶的荧光信号ROI值从第1天至第16天逐渐增长(P＜0.01)。
2.根据免疫组化评分法，A组E-cad在细胞膜表面的阳性表达率为75.0%，B组E-cad在细胞膜表面的阳性表达率为91.7%，C组E-cad在细胞膜表面的阳性表达率为33.3%。各组异位病灶组织的E-cad蛋白表达率相比，B组高于A组（P＜0.05）,A组明显高于C组（P＜0.001）。
3.A组E-cad启动子区的DNA甲基化率为15.142±0.378%，B组E-cad启动子区的DNA甲基化率为11.58±0.214%，C组E-cad启动子区的DNA甲基化率为19.227±0.198%。各组异位病灶的DNA甲基化率相比，C组明显高于A组（t=0.998,P＜0.01）,A组明显比B组高（t=1.013,P＜0.01）。
结论：
1.EGCG可降低子宫内膜异位病灶E-cad启动子区的DNA甲基化率，这可能是影响E-cad在细胞膜表面表达的机制之一。
2.EGCG可有效地抑制动物模型中子宫内膜异位病灶的生长。
子宫内膜异位症（endometriosis，EMT）是指子宫内膜组织（包括腺体和间质）出现在子宫体以外的部位，最常见的发病部位包括宫骶韧带、卵巢，其次为子宫及其他脏腹膜、阴道直肠隔等部位。关于子宫内膜异位症发生、发展的机制至今尚未完全明确，最经典的学说是以经血逆流为主导的Sampson种植学说，另外可能的机制包括免疫系统异常、体腔上皮化生学说、不良生活方式影响、环境对机体的影响等，以及近期的热点方向如表观遗传学异常等。这些因素中有可能某几个或全部联合发挥作用，或者由于潜在生物学途径的特定的亚型疾病而引起病变。
EMT的治疗方式主要有手术治疗和药物治疗，手术后或停药后均存在复发的问题，且手术治疗在一定程度上可破坏卵巢功能，手术后仍存在较高的复发率。药物治疗是以抑制卵巢功能为目的，并可引起一系列的围绝经期症状，以及肥胖、痤疮和多毛等不良反应。因此，欲彻底治疗EMT则需从其发病机制入手，研究一种疗效显著且副作用较少的药物，是如今我们迫切需要解决的问题。
在引起EMT的机制学说中，表观遗传学异常学说在近年来逐渐得到人们的关注。表观遗传的现象很多，已知的有DNA甲基化（DNAmethylation），基因组印记（genomicimprinting），母体效应（maternaleffects），基因沉默（genesilencing），核仁显性，休眠转座子激活和RNA编辑（RNAediting）等。DNA异常甲基化是表观遗传学异常的现象之一。DNA异常甲基化有可能参与了EMT的发生发展，EMT中的基因表达异常可能与激素和环境因素息息相关。越来越多的证据表明，EMT的发生有一部分原因是由于表观遗传异常引起的。E-cad作为一种位于上皮细胞的细胞膜表面的跨膜糖蛋白，其功能是作为细胞与细胞之间的粘合剂，参与维持上皮细胞的极性和完整性。E-cad基因(CDH1)参与调节细胞分化及生物学行为的多种过程，包括细胞极化、细胞迁移和癌灶转移。越来越多证据显示，E-cad表达的下调与上皮性细胞的迁移及上皮性肿瘤的扩散有关。而CDH1的高甲基化可能会引起E-cad的表达异常，从而影响参与上皮性肿瘤的转移。CDH1的异常甲基化状态不仅与上皮性肿瘤的转移有关，有可能与EMT也有关。研究表明，在EMT患者中，其E-cad基因启动子区CpG岛呈现出高甲基化状态。E-cad基因的高甲基化可能与子宫内膜异位症中DNMT家族、雌激素和孕激素受体基因、芳香化酶家族的异常表达相关。这其中的一种或几种因素共同作用可能是导致子宫内膜异位症发病的重要原因。
EGCG是绿茶的提取物，除了众所周知的抗氧化作用以外，它最早在1987年被证实具有抗肿瘤作用。EGCG的抗癌作用已被发现有多种分子机制，包括抑制与EGFR结合的配体结合；抑制尿激酶、蛋白激酶C、脂氧合酶和环氧化酶活性；诱导肿瘤细胞凋亡坏死及引起肿瘤细胞周期的停滞等。此外，EGCG也能抑制DNMT表达，并能将多瘤抑制基因、p53基因等抑癌基因的高甲基化状态逆转。有学者报道，在具有与恶性肿瘤生物行为学相似的良性疾病——子宫内膜异位症中，EGCG也同样发挥一定的作用。EGCG及其前体能改变子宫内膜异位症中某些基因的甲基化状态，使其转录的蛋白表达增加，使异位病灶显著地缩小，抑制病灶内功能性和机构性的微血管，从而使病灶加速凋亡。
前期研究表明，E-cad启动子区甲基化状态异常在子宫内膜异位症发生、发展的机制中具有一定影响作用。
本课题利用慢病毒载体介导红色荧光蛋白和荧光素酶基因于体外成功转染人的子宫内膜组织后，通过腹腔注射种植内膜组织，成功构建可示踪的内异症裸鼠模型，在不同的药物干预下，利用活体成像仪实时动态监测异位病灶的变化情况。采用免疫组化及焦磷酸测序等生物学技术，探究上皮型钙黏蛋白在细胞膜表面的分布情况及E-cad基因启动子区CpG岛上DNA甲基化状态，进一步探索EGCG对EMT的治疗功效及其可能的作用机制。
目的：
1.EGCG能否改变E-cad在异位细胞的细胞膜表面的分布情况。
2.在子宫内膜异位症中，EGCG能否改变异位的内膜细胞E-cad启动子区CpG岛上的DNA甲基化状态。
3.评价EGCG对动物模型中子宫内膜异位病灶的作用价值。
方法：
根据前期实验，人子宫内膜异位症可示踪的裸鼠模型已成功建立。将上述裸鼠模型随机分为三组，分别为A组（EGCG组）、B组（地西他滨组）和C组（注射用水组）。每2天一次将等体积分数的EGCG、地西他滨和注射用水腹腔注射到每组裸鼠体内。自腹腔种植内膜组织后第一天起，用活体成像仪每4天一次监测异位病灶的生长情况。16天后，颈椎脱臼法处死裸鼠并分离病灶，通过免疫组化法测定种植前、种植后各组E-cad在细胞膜表面的分布情况，以及通过焦磷酸测序法检测种植前、种植后各组E-cad基因启动子区CpG岛的DNA甲基化状态。
结果：
1.A组和B组的异位病灶的荧光信号ROI值在第1天至第8天逐渐增长（P＜0.01），在第8天至第16天之间逐渐缩小（P＜0.01)。C组异位病灶的荧光信号ROI值从第1天至第16天逐渐增长(P＜0.01)。
2.根据免疫组化评分法，A组E-cad在细胞膜表面的阳性表达率为75.0%，B组E-cad在细胞膜表面的阳性表达率为91.7%，C组E-cad在细胞膜表面的阳性表达率为33.3%。各组异位病灶组织的E-cad蛋白表达率相比，B组高于A组（P＜0.05）,A组明显高于C组（P＜0.001）。
3.A组E-cad启动子区的DNA甲基化率为15.142±0.378%，B组E-cad启动子区的DNA甲基化率为11.58±0.214%，C组E-cad启动子区的DNA甲基化率为19.227±0.198%。各组异位病灶的DNA甲基化率相比，C组明显高于A组（t=0.998,P＜0.01）,A组明显比B组高（t=1.013,P＜0.01）。
结论：
1.EGCG可降低子宫内膜异位病灶E-cad启动子区的DNA甲基化率，这可能是影响E-cad在细胞膜表面表达的机制之一。
2.EGCG可有效地抑制动物模型中子宫内膜异位病灶的生长。