背景尽管近十年来肺结核的发病率在全球范围内有所下降,肺外结核的发病率却有逐渐上升的趋势。骨与关节结核是最主要的肺外结核类型,约占所有肺外结核的10%-11%。目前,修复骨缺损与维持抗结核药物在病灶的有效浓度仍然是骨与关节结核治疗的两大主题。由于硬化壁等特殊结构的存在,传统的口服抗结核药物难以渗入病灶并维持有效的药物浓度。长期大量口服抗结核药物容易导致一系列的全身毒副作用,这也成为传统疗法所需要面对的一大难题。药物缓释体系作为一种新型的给药方式能在局部保持长效而稳定的药物释放,在骨与关节结核等慢性感染性疾病的治疗领域有广阔的应用前景。近年来国内外对聚乳酸(PLA)及其与羟基乙酸的共聚物(PLGA)进行了广泛而深入的研究,证明它们能有效地延长药物作用时间,提高定向性并降低毒副作用,是理想的药物缓释载体。骨与关节结核患者在外科手术治疗后通常会留下残腔缺损,清创后在残腔内植入自体骨或骨替代材料有助于局部力学结构的重建并促进新生骨形成。虽然临床上最为常用及最理想的植骨材料是自体骨,但是取自体骨带来的二次手术损伤、取骨区术后的顽固性疼痛以及无法事先与抗结核缓释材料结合等原因都使得自体骨无法成为骨与关节结核最理想的植入材料。传统的钙磷材料虽然可以在体内被完全降解且可以事先与抗结核缓释材料结合,但是它只有骨传导性而无诱导成骨的作用,这也限制了它在血供不丰富的区域的应用。研究表明可吸收成骨材料相对于传统的不可吸收植入材料具有在体内逐步降解的优势,这既保证了植入缺损区的成骨材料在一开始能保证一定的机械支撑强度,又保证它在后期又不会妨碍新生组织的生长。带表面负电荷的硫酸钙/β-磷酸三钙复合骨水泥Genex(?)是英国百赛公司生产的新型骨填充材料。相对于传统的钙磷材料,其表面独有的负电荷能对异种电荷产生定向吸附的作用,这有利于吸附聚集体液和血浆中的各种分子、蛋白和骨形成相关因子如骨形态发生蛋白等物质从而诱导骨形成。由于其具有无毒性,易于塑形,可诱导成骨以及在生物体内能完全降解等优点,Genex(?)骨粉已经被应用于临床的骨修复手术治疗。考虑到Genex(?)骨粉可以事先与抗结核药物缓释体系结合,它对骨与关节结核的治疗而言可以成为一种理想的局部植入支架材料。目的制备一种可局部植入的、具有一定缓释效应的、降解时间与成骨过程相适应的、生物相容性良好的以及成骨性能优秀的复合材料。通过对抗压强度及最大压缩力这两个生物力学指标的检测以确定复合材料的最佳构成比例,通过扫描电镜了解材料的各项物理性质。通过体内外实验验证材料的缓释性能、生物安全性及成骨性能。材料与方法通过乳化溶媒挥发法制备利福平-聚乳酸羟基乙酸共聚物载药微球并将其与带负电荷硫酸钙/β-磷酸三钙复合骨水泥结合制备成一种新型的复合抗结核支架材料。分别以0%、2.5%、5%、7.5%以及10%的比例混合缓释微球以及双相骨水泥并将其制成底面直径为3mm,高为6mm的圆柱体。待复合材料硬化成型后通过电子式万能试验机测定复合支架材料的最大压缩力及抗压强度以确定复合材料的最佳混合比例;通过扫描电镜观察缓释微球及复合支架的大体观以确定微球的粒径以及分布等物理特性,同时也观察微球与复合材料的结合情况。通过紫外分光光度计用直接法测定缓释微球的包封率与载药率;通过将单纯利福平、缓释微球以及复合支架材料分别置于透析袋中并置于水平摇床中水平震荡。于第1,3,7,14,21,28天取上清液用紫外分光光度法测定上清液药物浓度以确定药物的体外缓释性能。通过在成年雄性SD大鼠的肌袋模型中植入复合抗结核支架材料以验证抗结核复合支架材料的体内缓释性能。于术后1,3,7,14,21,28天处死实验对象并取材来检测不同时间点的局部药物浓度以及血液药物浓度。将36只成年雄性SD大鼠随机分成阳性对照组,实验组及阴性对照组并分别于股四头肌肌袋中植入单纯利福平、复合抗结核支架材料以及假手术对照。通过术后7天及28对实验对象的肝体重比及肝病理切片进行观察对比以评价抗结核复合支架材料的生物相容性。对24只成年雄性SD大鼠的颅骨两侧各造1直径为5mm的缺损模型,并在其中分别随机植入空白支架材料,复合支架材料以及空白对照处理并于术后6周取材,分别进行X线检测,micro-CT扫描以及颅骨病理切片观察以评价抗结核复合支架材料的成骨性能。结果未与缓释微球复合的Genex(?)骨水泥的抗压强度及最大压缩力分别(11.50±2.88)Mpa及(0.08±0.02)kN,当混合比例小于等于7.5%时复合支架材料的抗压强度与最大压缩力均无明显变化。当混合比例达到10%时复合支架材料的抗压强度与最大压缩力分别为(6.67±0.82)Mpa和(0.05±0.01)kN,与单纯双相骨水泥材料相比无论是抗压强度还是最大压缩力均显著降低(P<0.05)。因此我们确定复合支架材料的最佳混合比例为微球:抗结核复合支架材料=7.5:100(W:W)。扫描电镜下可观察到缓释微球呈表面光滑的均匀球状,平均直径约为20μm,微球分布均匀,无明显重叠现象。空白支架材料在电镜下可观察到联合交锁的微结构,材料内部可见分布均匀的微孔。复合支架材料与空白双相骨水泥的区别在与散在分布的,镶嵌在联合交锁的微结构中的缓释微球。通过直接法重复测定三次后缓释微球的平均包封率与载药率分别为(56.05±5.33)%和(29.80±2.88)%。在体外缓释试验中,通过紫外分光光度法测得单纯利福平在第三天的药物累积释放率即达到(99.23±0.24)%,微球组及复合材料组在第三天的体外累积释放率分别为(34.59±2.17)%和(34.59±2.17)%,第14天的体外累积释放率分别为(61.21±2.26)%和(53.55±2.56)%,第28天的体外累积释放率分别为(84.27±2.65)%和(69.88±3.03)%。通过高效液相色谱法检测得在术后第1天、第3天、第7天、第14天、第21天及第28天的局部肌肉药物浓度分别为(54.83±1.11)βg/g、(73.94±6.46)μg/g、(30.94±1.50)μg/g、(18.45±0.71)μg/g、(17.87±1.24)μg/g 和(14.96±0.33)μg/g;全身血药浓度分别为(5.49±0.37)βg/ml、(4.75±0.23)μg/ml、(3.35±0.55)μg/ml、(1.26±0.09)βgl、(1.04±0.05)βg/ml 和(0.90±0.03)μg/ml。就抗结核复合直接材料的生物安全验证实验而言,阳性对照组、实验组以及阴性对照组在术后第7天的肝体重比分别为(3.985±0.26)%、(3.985±0.26)%和(3.02±0.13)%,术后第 28 天的肝体重比分别为(2.92±0.27)%、(2.92±0.27)%和(2.95±0.11)%。无论在术后第7天以及在术后第28天阳性对照组的肝体重比均明显高于实验组与阴性对照组(P<0.05),而实验组与对照组之间均无明显差异(P>0.05)。在肝脏病理切片方面,实验组及阴性对照组在两个时间点的切片观察结果相似:肝小叶清晰可见,肝细胞排列较整齐,汇管区未见胆管增生,未见炎细胞浸润。阳性对照组的肝脏病理切片在第7天时可见大量炎性水肿的肝细胞,汇管区可见胆管轻微增生;在第28天可见肝细胞的炎性水肿情况略有好转,但肝细胞损害较其他两组比较仍非常明显。术后1天的X线检测结果显示复合支架材料组及单纯双相骨水泥组的密度明显高于正常骨组织,植入材料6周后缺损区域的密度接近于正常骨组织。阴性对照组6周后缺损区域密度无明显改变,但仍明显低于周围骨组织。Micro-CT三维成像结果显示阴性对照组在手术6周后缺损区域除边缘部可见少量新生骨外无明显骨组织,单纯支架材料组与复合支架材料组均可见大量新生骨形成,缺损区域基本被新生骨组织与尚未降解的材料填满。Micro-CT的分析结果显示手术6周后阴性对照组的骨体积以及骨体积分数均显著低于单纯支架材料组以及复合支架材料组(P<0.05),而实验组与对照组之间均无明显差异(P>0.05)。6.术后6周阴性对照组的病理切片仅在缺损周边可见少量新生骨,缺损区域中心无新生骨出现,缺损区域仅靠一层纤维结缔组织连接。实验组与对照组之间的病理切片表现较为相似:在缺损区域周边可见大量新生骨形成,新生骨中可见丰富的毛细血管与未完全降解的材料,缺损区域中心可见明显的骨膜下成骨。结论通过乳化溶媒挥发法成功制备利福平-聚乳酸羟基乙酸共聚物载药微球并将其与带负电荷硫酸钙/β-磷酸三钙复合骨水泥结合制备成一种新型的复合抗结核支架材料。通过体内外实验证明了微球与复合支架材料具有长效缓释作用,也证明了复合支架材料具有良好的生物相容性。经过6周的实验观察证明:与缓释微球结合后并未影响带负电荷硫酸钙/β-磷酸三钙复合骨水泥的成骨性能且复合缓释支架材料表现出优异的成骨性能。构建出来的新型的复合抗结核支架材料的各方面性能经过验证后结果令人满意,为骨与关节结核患者的治疗提供了一种有效的替代方案。