抑郁症是一种常见的情感性障碍,以显著而持久的心境低落为主要临床特征,且心境低落与其处境不相称,严重者可出现自杀念头和行为。最新调查显示,抑郁症影响了世界上大约10%的人口,并且16%的人在一生的某个时期会受其影响。在我国,抑郁症患者发病率约3%-5%,其自杀率在所有精神障碍中居首位。这对人们的生命财产造成了很大威胁,严重影响了人们的生活质量随着当前社会经济的发展,生活节奏的加快,抑郁症发病率逐年增长,加之抑郁症发病机理复杂,研究抑郁症的治疗药物及其作用机理已经成为当今社会的研究热点。祖国传统医学将抑郁症纳入“郁证”范畴。近年来,抑郁症“从肾论治”日益受到关注,有学者提出肾虚不能助肝气升发疏泄,才是肝气郁结或久郁不解的根本原因,认为抑郁症应从肾论治,以益肾补虚、调气安神为大法进行治疗哈蟆油(Ranae Oviductus, RO)为蛙科动物中国林蛙(Rana temporaria chensinensis David)雌蛙的输卵管,经采制干燥而得,味甘、咸,性平,归肺、肾经,具补肾益精、养阴润肺的功效,用于病后体弱,神疲乏力,心悸失眠,盗汗,劳嗽咳血,收载于2010年版《中国药典》。本课题以中医药理论和哈蟆油的应用背景为依据,以课题组前期对抗焦虑和抗抑郁物质基础及机制的研究为基础,采用现代医学研究方法对哈蟆油抗抑郁有效部位进行了筛选,并对初步药效学和作用机制进行了研究,旨在为研发新型、有效和独特的治疗抑郁症新药提供理论依据,为抑郁症“从肾论治”的思路奠定基础,从而扩展抗抑郁中药的应用。主要研究内容和结果如下：1文献研究1.1抑郁症的中医药研究进展以中医药理论为指导,归纳总结了历代医家对抑郁症的概念认识,病因病机和辨证施治研究,综述了目前治疗抑郁症的常用中药复方及单味药。1.2抑郁症的发病机制研究现状查阅整理了国内外抑郁症发病机制的文献资料,从神经递质-受体系统、神经内分泌系统、免疫系统、第二信使系统和脑源性神经营养因子多个方面探讨了抑郁症的发病机制。1.3抑郁症动物模型的研究概况整理了国内外常用的抑郁动物模型研究报道,将其分为应激模型、脑损伤模型、药物诱发的抑郁模型、孤养或分离模型、转基因动物模型和其他模型六大类。1.4哈蟆油的化学成分及药理活性研究进展查阅整理了哈蟆油的主要化学成分和现代药理活性研究。2实验研究2.1哈蟆油抗抑郁有效部位及起效时间初筛提取哈蟆油粉末,依次得到石油醚浸膏(A)、乙酸乙酯浸膏(B)、正丁醇浸膏(C)和95%乙醇浸膏(D),溶于生理盐水后连续灌胃给药14天,给药剂量相当于临床等效剂量,分别在第7、8、10和14天采用小鼠悬尾实验和小鼠强迫游泳实验筛选出哈蟆油抗抑郁的有效部位及起效时间。小鼠悬尾实验结果显示在第7天时,与空白组比较,A部位组能显著缩短小鼠的不动时间(P<0.05)；在第8天时,与空白组比较,A和D部位组能显著缩短小鼠的不动时间(P<0.05)；在第10天时,与空白组比较,阳性组、A和D部位组能显著缩短小鼠的不动时间(P<0.05)；在第14天时,与空白组比较,阳性组、A和D部位组能显著缩短小鼠的不动时间(P<0.01)。小鼠强迫游泳实验结果显示在第7、8、10和14天,各组大鼠不动时间均无显著性差异,但是阳性组和哈蟆油各部位组均有减少不动时间的趋势。结果表明,哈蟆油A部位和D部位在小鼠悬尾模型上具有较好的抗抑郁作用,哈蟆油各组抗抑郁作用的强弱为A部位>D部位>C部位>B部位,起效时间为第8天最佳。哈蟆油各组在小鼠强迫游泳模型上没有表现出明显的抗抑郁作用,但比较而言,哈蟆油A部位和D部位减少不动时间的趋势更为明显。2.2哈蟆油石油醚部位(ROS)抗抑郁作用实验研究2.2.1ROS抗抑郁作用的最佳剂量和初步机制探讨采用小鼠自主活动实验、小鼠强迫游泳实验和小鼠悬尾实验考察了ROS不同剂量(分别为10、30、100、300、900mg/kg)的抗抑郁作用,并用放射免疫法初步探讨了ROS不同剂量对小鼠血清皮质酮的影响。实验结果显示各组间小鼠自主活动无显著性差异(P>0.05)；在小鼠强迫游泳实验中,与空白组比较,氟西汀组和ROS100mg/kg剂量组能显著缩短小鼠的不动时间(P<0.05),其他剂量组也有减少不动时间的趋势；在小鼠悬尾实验中,与空白组比较,氟西汀组和ROS100,300和900mg/kg剂量组均能显著缩短小鼠的不动时间(P<0.05),其他剂量组也有减少不动时间的趋势；皮质酮检测结果显示,与空白组比较,阳性组和ROS100,300和900mg/kg剂量组能显著降低小鼠血清皮质酮水平(P<0.05)。结果表明,氟西汀和ROS100mg/kg剂量在小鼠强迫游泳模型上具有抗抑郁作用,氟西汀和ROS100、300、900mg/kg剂量在小鼠悬尾模型上具有抗抑郁作用,可缓解抑郁症状,并且这些抗抑郁作用并不是由于小鼠自主活动增强而引起的,其作用机制可能与下丘脑-垂体肾上腺轴(HPA轴)有关。2.2.2ROS对慢性应激刺激大鼠行为学的影响及机制探讨将大鼠随机分为空白组、模型组、阳性药物组(盐酸氟西汀10mg/kg)、ROS各剂量组(30,100和300mg/kg),建立慢性不可预见性温和应激模型,连续灌胃给药21天；观察大鼠体重变化,并用旷场实验和蔗糖偏好实验检测大鼠行为学变化；用酶联免疫吸附法(ELISA法)测定大鼠血清皮质酮的水平；用蛋白免疫印迹法(Western blotting)分析大鼠海马中脑源性神经营养因子(BDNF)的表达。实验结果显示,与正常组比较,慢性应激大鼠的体重显著减少(P<0.01),蔗糖偏爱度显著降低(P<0.01),在旷场实验中的运动距离明显减少(P<0.01),血清中皮质酮含量显著升高(P<0.01),海马中BDNF的蛋白表达显著降低(P<0.01)。与模型组比较,ROS100mg/kg能明显改善抑郁大鼠体重的下降(P<0.05),增加蔗糖偏爱度(P<0.01)和在旷场实验中的运动距离(P<0.05),降低大鼠血清皮质酮的水平(P<0.01),增加大鼠海马中BDNF的蛋白表达(P<0.01)。结果表明,ROS具有明显的抗抑郁作用,其作用机制可能与调节HPA轴功能和提高BDNF的表达有关。2.2.3ROS抗抑郁作用的化学成分分析用GC-MS法检测了ROS中的化学成分,共鉴定出28种成分,占色谱总流出峰面积的89.35%。其中脂肪酸甲酯类物质15种,占峰面积的61.27%,棕榈酸含量最高；酮类物质2种,占峰面积的16.29%；甾醇类物质5种,占峰面积的8.67%；酰胺类物质1种,占峰面积的2.75%；烷烃类物质3种,占峰面积的0.28%；酚类物质2种,占峰面积的0.09%。脂肪酸类、甾醇类和酰胺类物质和文献报道一致二丁基羟基甲苯、3,5-二叔丁基苯酚、5-十四基二氢-2(3H)-呋喃酮和四氢-6-十三烷基-2H-吡喃-2-酮为首次报道。通过文献研究,可推测ROS抗抑郁作用的活性成分可能为脂肪酸、酰胺类和二丁基羟基甲苯,或是这些化学成分相互作用产生的新产物。3,5-二叔丁基苯酚、5-十四基二氢-2(3H)-呋喃酮和四氢-6-十三烷基-2H-吡喃-2-酮是否具有抗抑郁作用还有待于进一步研究。2.31-甲基海因抗抑郁作用实验研究2.3.1哈蟆油D部位中1-甲基海因的定性分析用高效液相色谱法(HPLC法)将供试品溶液和1-甲基海因对照品溶液进行了比较,结果显示,哈蟆油D部位中含有1-甲基海因,且含量较高。2.3.21-甲基海因的合成及纯度检测参照文献,用化学方法对1-甲基海因进行合成,然后用HPLC法将1-甲基海因供试品溶液和对照品溶液作对比,结果显示合成的1-甲基海因纯度达98%以上。2.3.31-甲基海因对冷水游泳应激大鼠行为学的影响及机制探讨采用慢性冷水游泳应激(chronic forced swim stress)方法建立大鼠抑郁模型。氟西汀(10mg/kg)和1-甲基海因(20,40和80mg/kg)在造模完成后灌胃给药,每天1次,连续14天。观察大鼠体重变化,并用旷场实验和蔗糖偏好实验检测大鼠行为学变化；用ELISA法测定大鼠血清皮质酮的含量；用Western blotting法分析大鼠海马中BDNF蛋白的表达水平。结果显示,与正常组比较,慢性冷水游泳应激大鼠的体重显著减少(P<0.01),蔗糖偏爱度显著降低(P<0.05),在旷场实验中的运动距离明显减少(P<0.01),血清中皮质酮含量显著升高(P<0.01),海马中BDNF的蛋白表达显著降低(P<0.01)。与模型组比较,1-甲基海因40mg/kg能明显改善抑郁大鼠体重的下降(P<0.05),增加蔗糖偏爱度(P<0.01)和旷场实验中的运动距离(P<0.01),降低大鼠血清皮质酮的水平(P<0.05),增加大鼠海马中BDNF的蛋白表达(P<0.01)结果表明1-甲基海因具有明显的抗抑郁作用,其作用机制可能与调节HPA轴功能和提高BDNF的表达有关。