蛹虫草多糖的分离纯化、结构解析及其免疫调节活性研究

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蛹虫草(Cordyceps militaris)是一种传统的食药用真菌,因其具有与冬虫夏草相似的药理活性,在中国及其它亚洲国家已被广泛作为民间滋补食品。多糖作为蛹虫草中的主要活性成分,具有增强免疫力、抗肿瘤、降血糖、降血脂及减肥等功效。且现代医学研究表明,多糖的免疫调节活性在改善老年人和癌症患者的身体免疫防御机制中起着重要作用。为进一步明确蛹虫草多糖的结构及其免疫调节活性,本论文先利用大孔吸附树脂对粗多糖进行脱色与除蛋白处理,随后利用柱层析技术进一步分离纯化获得3种均一的多糖组分,最终筛选得到具有优良免疫活性的新组分CMP-Ⅲ。并结合多种光学及化学分析手段对CMP-Ⅲ进行结构表征,以小鼠单核巨噬细胞RAW264.7为研究载体,通过考察对巨噬细胞的吞噬能力、NO及免疫相关细胞因子(IL-6、TNF-α)分泌情况及其m RNA表达量的影响,对MAPK、NF-κB信号通路相关蛋白水平的调控,进而探讨蛹虫草多糖CMP-Ⅲ组分对巨噬细胞的免疫调节活性及其作用机制。主要研究结果如下:(1)优化蛹虫草粗多糖一步法脱色与除蛋白工艺从10种不同性质的大孔吸附树脂中筛选出吸附效果最佳的NKA-9树脂,其脱色率、除蛋白率及多糖保留率分别为80.69%、62.51%及78.08%。静态吸附结果表明NKA-9树脂最佳吸附条件为吸附时间120 min、室温、自然p H及初始样品浓度2.5mg/m L;动态吸附结果表明最适上样流速为0.5 BV/h,最佳样品处理体积为4倍柱体积。(2)筛选得到优良免疫活性的蛹虫草多糖新组分利用DEAE-52层析柱对蛹虫草粗多糖进行初步纯化,依次用蒸馏水、0.1 M和0.3 M Na Cl溶液洗脱得到三个组分,采用Sephadex G-100和G-200柱层析进一步纯化,分别获得CMP-Ⅰ、CMP-Ⅱ和CMP-Ⅲ三个组分。经GPC检测可知CMP-Ⅰ、CMP-Ⅱ为均一组分,其分子量分别为5.948×103 Da、1.529×104 Da,但已有文献报道相似分子量的蛹虫草多糖组分。通过分子量及均一性检测、细胞活性跟踪筛选确定CMP-Ⅲ为蛹虫草多糖新组分,该组分具备进一步深入研究的价值。(3)CMP-Ⅲ组分的理化性质及结构分析采用硫酸苯酚法、考马斯亮蓝法、间羟基联苯法、氯化钡-明胶法、福林酚法对CMP-Ⅲ组分的理化性质进行测定。结果表明CMP-Ⅲ组分的总糖含量为89.47%,蛋白质含量为0.895%,糖醛酸含量为2.628%,硫酸基含量为2.550%及多酚含量为0.815%。由分子量测定、单糖组成分析、红外光谱扫描、甲基化反应及核磁共振分析,表明CMP-Ⅲ重均分子量(Mw)为4.796×107Da,在浓度1 mg/m L、温度25℃的水溶液和DMSO中均呈现聚集紧缩的球形构象。该组分由葡萄糖、甘露糖和半乳糖组成,其占比分别为86.6%、10.7%和2.7%。FT-IR光谱分析初步判断主要为α-吡喃型多糖,结合甲基化反应和NMR分析比对结果,推测CMP-Ⅲ的主要骨架主链可能由→4)-α-D-Glcp-(1→4)-α-D-Manp-(1→构成,β-D-Manp残基作为支链连接于→4,6)-α-D-Manp-(1→上的C-6位置。(4)CMP-Ⅲ组分的免疫调节活性以巨噬细胞RAW264.7为研究载体,结果表明CMP-Ⅲ作用于该细胞的安全浓度低于200μg/m L即可,给予不同浓度的CMP-Ⅲ溶液(25、50、100、200μg/m L)刺激后,不同程度增强了巨噬细胞的吞噬活性,通过诱导巨噬细胞中ERK1/2、JNK1/2及p38蛋白磷酸化来激活MAPKs信号通路。同时通过激活NF-κB信号通路,即刺激IκBα和NF-k B p65蛋白磷酸化,使NF-k B p65从细胞浆移位至细胞核,促进i NOS、IL-6和TNF-αm RNA的表达量显著升高,进而显著促进巨噬细胞NO和免疫相关细胞因子IL-6、TNF-α表达分泌,最终发挥免疫调节活性。
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