精子表面的IZUMO1与卵子表面的JUNO之间的相互作用是哺乳动物精卵融合的必需条件,但仅有IZUMO1与JUNO相互作用还不足以导致膜融合,因此一定还有一些精子或卵子蛋白可能参与精卵膜融合。为了进一步寻找可能同JUNO和IZUMO1这两个重要分子有作用的精卵蛋白,实验室利用酵母双杂交技术进行了初步的筛查,筛查后的测序结果表明,一个名为ENO1的蛋白可能与IZUMO1和JUNO存在相互作用。随后本文用酵母双杂交和免疫共沉淀技术鉴定了大鼠ENO1与IZUMO1的相互作用,并用间接免疫荧光技术观察了ENO1在大鼠精子和卵子上的定位以及与IZUMO1的共定位。还用抗体抑制和体外受精技术测定了ENO1对小鼠卵子受精的影响,以鉴定ENO1是否可能参与精卵膜融合过程。实验先克隆了大鼠eno1的cDNA。构建了pGAD-eno1酵母表达载体与实验室已有的pGBK-Juno以及pGBK-Izumo1酵母表达载体进行了酵母双杂交实验。结果表明ENO1与IZUMO1存在相互作用,但与JUNO不存在相互作用。构建了pCMV-Flag-eno1真核表达载体,与实验室已有的pCMV-HA-Izumo1共转染HEK 293 T细胞进行了免疫共沉淀实验,结果表明ENO1与IZUMO1存在相互作用。为了研究ENO1在精子和卵子上的定位以及是否影响受精。本实验还构建了pET-28a-eno1原核表达载体,诱导表达ENO1-HIS融合蛋白,免疫实验兔后获得了兔抗大鼠ENO1血清多克隆抗体。构建了pGEX-eno1原核表达载体诱导表达ENO1-GST融合蛋白,免疫小鼠并注射S180细胞后获得了小鼠抗大鼠ENO1腹水多克隆抗体。利用纯化后的自制ENO1抗体和实验室的IZUMO1抗体分别研究了ENO1在大鼠精子、小鼠卵子中的亚细胞定位及其在大鼠精子中与IZUMO1的共定位情况。结果显示:ENO1位于小鼠MII期卵子的细胞膜及细胞质中,位于大鼠精子顶体反应前尾部及顶体反应后头部和尾部。ENO1与IZUMO1在顶体反应后的大鼠精子头部有共定位。用纯化后的自制ENO1抗体处理小鼠精子和卵子后,体外授精实验结果表明,经ENO1抗体处理后的精卵受精率低于未处理精卵的受精率,但差异不显著。