研究目的与背景:皮下软组织缺损虽不是特别棘手的临床问题,但却因其在临床上尤为常见,一直困扰着临床医生,据美国整形外科协会报道,仅2015年一年修复重建类手术便有逾580万例。传统治疗手段经常是“拆东补西”,造成供体部位局域的组织畸形、感染和移植组织不存活等问题。组织工程学是最有前景的方法。组织工程构架中必不可少的三要素之一就是组织工程支架,并且,理想的支架材料应具有一定三维结构和细胞外基质（ECM）的功能。本研究主旨在深入探讨和研发新型组织工程支架用于皮下软组织缺损的修复。因猪小肠粘膜下层（Porcine small intestinal submucosa,P-SIS）的脱细胞基质具有很好的组织相容性和生物活性,且猪小肠粘膜下层易于获得,成本较低,来源充足,本课题组前期制备了P-SIS的冷冻凝胶等材料,可用于皮下软组织缺损的修复,然而P-SIS的降解时间较快,或用化学交联的方法延长其降解时间,这种方法容易发生化学交联剂残留,影响细胞存活。随着材料学的发展和深入研究,越来越多的生物可降解聚合物被用于医疗领域,聚对二氧环己酮（poly（p-dioxanone）,PPDO）是脂肪族聚酯的一种,由于它的分子链上含有醚键,所以具有良好柔韧性、较强抗张强度、高打结强度等特点。在上世纪70年代后期被美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于外科缝合线材料,除上述特点,还具备降解时间缓慢,其降解产物与人体代谢产物一致,可完全被排出体外等优点。然而,其亲水性不好导致加工困难,并限制了它的开发与应用。因此本课采用了细胞外基质P-SIS和生物可降解PPDO为基材,制备了一种新型三维多孔支架材料,不仅具备细胞外基质的特性,还具备降解缓慢、拉伸强度高的特性,适合用做皮下软组织缺损的修复。研究方法:第一部分:脱细胞基质的制备、相关性能检测及脱细胞基质的选择1.猪心包膜脱细胞基质膜（P-PC）和猪小肠粘膜下层脱细胞基质膜（P-SIS）的制备以及相关检测,包括:DNA残留检测提取与鉴定有无细胞残留,外观特征大体观察,扫描电子显微镜观察微观结构,力学性能分析等;2.根据以上实验结果以及文献检索进行综合性分析,针对本课题需求,最终选择了P-SIS作为本课题复合支架的天然生物基质成分;3.P-SIS粉末的制备。第二部分:PPDO-SIS复合多孔支架的制备1.PPDO溶解实验,PPDO难溶于一般有机溶剂,故找到一种合适的有机溶剂用于复合材料的制备是必要的;2.PPDO成膜实验;3.PPDO-SIS复合支架的制备;4.PPDO-SIS复合支架的表征与微观结构,并与PPDO膜进行对照分析;5.PPDO-SIS复合支架的成分特征检测（采用傅里叶红外光谱分析FTIR和X射线衍射图谱分析XRD）,并与P-SIS膜和PPDO膜进行对照分析;6.PPDO-SIS复合支架的力学性能检测（对照组同上）;7.PPDO-SIS复合支架的热重分析（对照组同上）;8.PPDO-SIS复合支架在58℃的蛋白酶K溶液中和37℃的磷酸盐缓冲液PBS中的降解率测定（对照组同上）;9.PPDO-SIS复合支架的吸水性检测（对照组同上）。第三部分:PPDO-SIS复合多孔支架的体外生物学观察1.绿色荧光转基因小鼠脂肪间充质干细胞（ADSCs）的分离培养;2.PPDO-SIS支架材料与ADSCs的体外复合培养;3.CCK-8试剂盒检测细胞活性与增殖（P-SIS膜、PPDO膜为对照组）;4.扫描电镜（SEM）观察细胞状态。第四部分:PPDO-SIS复合多孔支架的体内实验观察1.制作小鼠皮下软组织缺损模型,实验分四个组:P-SIS膜组、PPDO-SIS复合支架组、PPDO膜组和空白对照组,将P-SIS膜、PPDO-SIS复合支架、PPDO膜分别埋置在小鼠皮下,观察各组材料对皮下软组织缺损的修复作用。2.通过组织切片的HE染色、免疫荧光检测CD34和免疫组织化学检测各组材料中CD90表达和Western blot检测CD31和VEGF表达情况,观察分析PPDO-SIS复合支架移植后的局部促血管化和细胞增殖情况。研究结果:1.制备出脱细胞的P-PC膜、P-SIS膜和P-SIS粉末。P-SIS粉末更利于复合支架的制备工艺要求。2.成功制备出PPDO-SIS复合支架。该支架经SEM观察,具有三维多孔结构,孔壁有微孔,在材料内部可实现互通。PPDO-SIS复合支架材料具有良好的吸水性能,与生物基质P-SIS膜相比,比P-SIS膜的吸水性稍高,与高分子聚合物PPDO膜相比,其吸水性能远高于高分子PPDO膜,且具统计学意义（p<0.05）。FTIR检测PPDO-SIS复合支架显示波数为1736cm^-1的C=O伸缩振动吸收峰,在1221cm^-1、1126cm^-1、1052cm^-1显示了C-O伸缩振动峰,说明共混后的PPDO-SIS复合支架依然保有PPDO的化学结构特征。XRD结果显示PPDO-SIS复合支架的X射线衍射峰主要出现在2θ角为21.92°、23.78°和29.12°,证实了P-SIS的混入对PPDO-SIS复合材料的晶体类型并没有影响,依旧显示的是PPDO的特征衍射峰。PPDO-SIS复合支架的应变率较P-SIS膜有所增加,可以满足皮下软组织缺损修复的力学要求。在蛋白酶K溶液中,48小时P-SIS的降解率高达近85%,PPDO-SIS复合支架约为10%,PPDO膜的降解率不到1%,通过统计分析得出,PPDO-SIS复合支架和P-SIS膜的降解率始终都有极为显著差异（P<0.01%）,和PPDO膜在12h时的降解率开始存在显著差异（P<0.05%）,随着降解时间的增加,这种差异趋于更为显著（P<0.01%）,这和PPDO-SIS复合支架中含有P-SIS成分有很大关系。PBS缓冲液中体外降解率实验结果显示,虽然PPDO-SIS复合支架材料与PPDO膜在四个时间观察点（1w、2w、3w、4w）的降解速率均存在极为显著的统计学差异（P<0.01%）,但是,PPDO-SIS复合支架在4w时的降解率也仅为25%。PPDO-SIS复合支架材料具有良好的吸水性能,比P-SIS膜稍高,与PPDO膜相比,其吸水性能远比高分子PPDO膜要高,且具统计学意义（p<0.05）。3.荧光显微镜和扫描电镜观察结果可见带有绿色荧光的ADSCs细胞在P-SIS膜、PPDO-S复合支架材料以及PPDO膜上均能广泛分布生长,通过扫描电子显微镜可以清晰的看到细胞形态呈梭形,伸展良好,特别是可见ADSCs在PPDO-SIS复合支架的孔壁上生长。通过CCK-8试剂盒测试出的24h PPDO-SIS复合支架与PPDO膜存在着显著差异（P<0.05）。测出第1d、3d、5d、7d的CCK-8吸光度显示了各组材料的细胞增殖情况,P-SIS膜的细胞增殖最好,PPDO-SIS复合支架也较好,PPDO膜最差,但随着时间的推移,PPDO-SIS复合支架的细胞增殖与P-SIS膜的细胞增殖情况从极为显著差异（P<0.01）转变为显著差异（P<0.05）,然而,PPDO膜与PPDO-SIS复合支架在任何时间观测点均存在极为显著的统计学差异（P<0.01）。4.不同支架材料埋置于小鼠的皮下软组织缺损部位,结果显示,P-SIS膜、PPDO-SIS复合支架、PPDO膜在小鼠体内均具有良好的组织相容性,都可以很好的生长,但在2周时,P-SIS就已经吸收的无定态形状,而PPDO-SIS复合支架仍保持原有的方形,在4周时仍能观察PPDO-SIS复合支架组和PPDO膜组仍分别有（0.57+0.06）cm和（0.55+0.07）cm,两者在剩余大小上没有显著差别。空白对照组在2周和4周时,小鼠背部仍能明显可以观察到皮下软组织缺损的凹陷。2周和4周的HE染色组织病理形态,各材料组均可见中性粒细胞浸润,P-SIS膜组和PPDO-SIS复合支架组更为明显。未能观察到P-SIS膜的残留,证实了P-SIS在体内吸收较快,另外,PPDO-SIS复合支架的孔壁可见细胞聚集,在4周时,各材料组均可见明显新生血管。CD34免疫荧光染色结果显示,P-SIS膜组、PPDO-SIS复合支架组和PPDO膜组均有CD34的阳性表达,并与空白对照组均有显著差异（P<0.05）。免疫组化结果显示PPDO-SIS复合支架的CD90表达明显高于空白对照组（P<0.05）。CD31和VEGF的Western blot检测结果显示不同材料均明显高于空白组（P<0.05）。结论:1.成功制备出的PPDO-SIS复合支架具有良好的三维多孔结构,理化性能符合组织工程支架要求。2.PPDO-SIS复合支架与ADSCs的体外复合培养证实PPDO-SIS复合支架具有良好的促细胞生长、增殖作用,可用于体内移植。3.PPDO-SIS复合支架材料体内降解缓慢,在空间上能起到占位性修复作用,支架可有效促进移植部位的血管化,利于细胞再生,可有效解决皮下软组织缺损的修复。