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目的大肠癌是我国常见的几种恶性肿瘤之一,目前对大肠癌筛查和诊断的方式、手段各有利弊,尚没有一种完全满意的方法。生物诊断学方法是目前最有发展前途的诊断方法之一,但是迄今只有少部分的生物诊断标志物被确定,而T细胞分化的中、后期表达MAL基因DNA甲基化对多种癌症有重要意义。本实验的研究目的就是去探讨MAL基因与大肠癌发病的关系,可否作为早期诊断结肠肿瘤分子标志物。材料与方法大肠癌标本收集:于2007-9至2008-9,安徽医科大学杭州临床学院经病理诊断明确的大肠癌手术切除标本及相应的癌旁组织各40例和正常人大肠组织10例,其中大肠癌组织,癌肿远端组织取自于大肠癌手术切除之标本,癌肿远端组织为远离癌肿5cm以上之结肠组织;正常人大肠组织来自行PPH手术之标本。所有患者术前均末接受放、化疗及其他抗癌治疗。所有患者术前均末接受放、化疗及其他抗癌治疗,标本切除后立即于-80℃冰冻保存用于下一步实验。RT-PCR:采用Trizol法抽提组织总RNA,实验步骤严格按照试剂说明书进行。紫外分光光度计检测RNA的浓度和纯度,A260/A280在1.8～2.0之间的RNA入选进行反转录。以两步法行RT-PCR。取PCR产物在2%的琼脂糖凝胶中进行电泳,凝胶成像仪扫描、拍照,用软件分析各条带灰度值,以目的基因与内参β-actin比值表示其相对含量。Western blot:从各种组织中提取总蛋白,将样品进行聚丙烯酰氨凝胶(SD-PAGE)电泳,12%的分离胶分离MAL蛋白,电泳后采用半干式转移法转移到PVDF膜上,膜用5%的脱脂牛奶37℃封闭1 h,加入一抗MAL抗体(MAL抗体,1∶1000),37℃孵育1h,HRP标记的兔抗鼠二抗(1∶1000),37℃孵育1h,β-actin单克隆抗体(1∶100)作为内参照,孵育3h,用ECL化学发光试剂盒检测杂交信号。MSP:酚一氯仿法提取基因组DNA进行亚硫酸氢钠修饰,利用使亚硫酸氢钠lugDNA变性,并进行亚硫酸氢钠修饰。DNA纯化系统对修饰后的DNA标本进行纯化,再次碱变性后乙醇沉淀,溶解后用于PCR扩增模板。PCR产物加于2.0%琼脂糖凝胶中电泳,0.1%EB染色,凝胶成像系统照相分析。结果判定:只要甲基化引物扩增出目的条带,则可判定MAL基因启动子发生甲基化。统计学分析:采用SPSS 13.0统计软件包处理数据,P＜0.05为有统计学意义。结果RT-PCR定性检测MAL-mRNA大肠癌癌组织中MAL-mRNA表达(阳性率为10.0%,4/40)明显低于相应的癌旁大肠粘膜(阳性率为85.0%,34/40)和正常大肠组织的表达(阳性率为100%,10/10)。与正常大肠组织相比,MAL-mRNA在大肠癌组织和癌旁组织粘膜中表达有显著性差异(P＜0.05)。利用Western Blotting分析MAL蛋白在大肠癌组织、大肠癌远端组织、正常大肠组织的蛋白表达,结果表明正常大肠组织抗原的17KD附近有一条特异性条带,大肠癌远端组织的15%(6/40)特异性条带或缺少或条带较弱,大肠癌组织80%(32/40)无特异性条带出现。相对于正常大肠组织内MAL蛋白表达,MAL蛋白在大肠癌组织和大肠癌远端组织表达失常,不表达或表达失常(80%,15%),差异有显著性(P＜0.05)。通过MSP检测,在40例大肠癌组织的MAL甲基化表达(阳性率为75.0%,30/40)明显高于40例大肠癌癌旁组织MAL甲基化表达(阳性率为12.5%,5/40)和大肠正常组织的MAL甲基化表达(阳性率为0%,0/10)。大肠癌组织、大肠癌癌旁组织MAL甲基化率分别与大肠正常组织甲基化率相比,差异有显著性(P＜0.05)。结论本研究工作以大肠癌组织、癌旁组织及对照组大肠正常组织为研究对象,研究大肠癌组织中MAL基因表达及其启动子甲基化状态,得出以下结论:1、大肠癌组织中MAL-mRNA表达缺失率较高,而癌旁组织中出现MAL-mRNA表达缺失或低表达,正常人结肠组织MAL-mRNA表达正常。2、正常组织的MAL蛋白表达正常,癌旁组织中MAL蛋白表达减少,大肠癌组织中MAL蛋白表达减少更为明显。3、大肠癌组织中MAL基因甲基化率最高,正常组织的MAL基因未能检测出甲基化,癌旁组织中MAL基因部分有甲基化。说明MAL-mRNA和MAL蛋白表达异常可能与大肠癌的发生相关,MAL基因启动子甲基化可能是MAL基因失表达的原因。MAL基因在大肠癌组织中甲基化发生率较高,在大肠癌旁组织中也出现了明显的甲基化,提示MAL基因甲基化是大肠癌发生的早期事件,提示MAL基因甲基化可作为大肠癌早期诊断的标志物,亦可能是大肠癌生物治疗的新靶点。