肝细胞癌在全球范围内都有很高的发生率和死亡率。据国际癌症研究机构公布的统计结果显示,肝癌的五年生存率仅有6.9%,到2020年,全球将会有909,742名患者死亡。我国是世界上肝癌发生率和死亡率最高的国家,拥有全球超过一半数量的肝癌患者,这给我们的社会和家庭造成了极大的经济负担,严重影响了我国人民的身体健康和生活质量。肝细胞癌的发生和发展是一个漫长并且极其复杂的过程,涉及到大量基因和蛋白的参与,如生长因子及其受体、致癌基因、抑癌基因、生长发育信号通路相关基因等等。迄今为止,对于晚期肝癌的治疗,还没有非常有效的药物,所以就迫切需要我们深入探索肝细胞癌发生和发展的具体机制,为肝癌的早期筛查、诊断和治疗提供新的潜在靶点,改善他们的生活质量,提高肝癌患者的生存率。在本实验室之前的研究中,我们发现HBV通过抑制mi R-340-5p的表达而促进肝癌细胞的迁移和侵袭能力。mi R-340-5p是一个长度约为22nt的非编码小R NA,在宫颈癌、结肠癌和乳腺癌的形成和发展过程中发挥抑癌的作用,参与机体的抗肿瘤反应。在本研究中,我们继续探究了mi R-340-5p对肝癌细胞增殖和凋亡的影响。通过CCK8实验、EDU实验和凋亡实验,证明了HBV可以通过mi R-340-5p调控肝癌细胞的增殖和凋亡过程;进一步,探究了其具体的分子机制。本研究通过mi RNA在线靶标预测网站和荧光素酶报告基因实验,鉴定了激活转录因子7（ATF7）为mi R-340-5p的直接靶标,并参与HBV-mi R-340-5p信号通路对肝癌细胞增殖和凋亡的调控;通过蛋白质免疫共沉淀实验和质谱分析,我们发现70K D热休克蛋白1B（HSPA1B）作为ATF7的相互作用蛋白,促进肝癌细胞的生长并参与HBV-mi R-340-5p信号通路的促肿瘤生长功能;最后我们在肝癌患者肿瘤组织样品和TCGA肿瘤数据库中都发现了ATF7和HSPA1B在肝癌样品中的高表达现象,这说明ATF7和HSPA1B蛋白可能在肝癌的形成过程中发挥了重要的作用。上述体外和体内实验结果阐述了HBV促进肝癌发生和发展的新机制,为进一步研究针对HBV的靶向药物提供了可靠的实验数据和理论基础。转录因子Sox（sry-related HMG box）属于HMG（高迁移率）-box超家族成员,广泛参与胚胎发育过程如神经系统发育、多能性干细胞的维持和诱导、性别决定、造血和软骨形成等过程。Sox3是Sox B1（包括Sox1,Sox2和Sox3）亚群中的一员,主要在中枢神经系统、小肠和性腺中丰富表达。研究结果表明,Sox3与X染色体相关的先天性多毛症、垂体功能减退和神经管缺陷等疾病的发生发展有密切的联系;随着研究的深入,近年来有文献表示Sox3具有致癌潜能,在宫颈癌、子宫内膜癌等肿瘤形成过程中发挥了重要作用,但Sox3在肝癌形成过程中的作用尚未阐述。本研究中,我们就通过一系列实验探究了Sox3在肝癌形成过程中的作用和具体机制。通过q RT-PCR实验,发现HBV促进Sox3的m RNA水平表达,这提示HBV可能通过Sox3行使其致癌功能。为了进一步探究该可能的致病机理,首先我们构建了Sox3过表达的稳转细胞系;我们发现当过表达Sox3时,肝癌细胞Hep G2的增殖、克隆形成以及迁移和侵袭能力都有明显的升高,更多的细胞进入了S期,开始DNA的复制;我们在Sox3高表达的肝癌细胞Huh7中敲低内源性Sox3表达也到了一致的结果。同时,我们在正常肝细胞LO2中也进行了验证,当过表达或者敲低内源性Sox3表达时,LO2细胞分别表现出促进或者抑制增殖和迁移的现象,这提示Sox3可能与肝癌的发生有高度的相关性,这也更加充分的说明了Sox3作为促癌因子参与了肝癌的形成和发展。其次,本实验还探究了Sox3促进肝癌细胞增殖的具体机制。通过筛选和验证,我们发现Sox3在m RNA水平上促进mi R-203a-3p的表达,而且功能实验也证明S ox3通过mi R-203a-3p发挥其促增殖效应;我们还通过在线靶标预测和双荧光实验鉴定了生长抑制特异蛋白2（GAS2）为mi R-203a-3p新的直接靶标。研究结果表明GAS2通过促进p53诱导的细胞凋亡而促进骨肉瘤的凋亡过程,所以我们检测了Sox3是否通过mi R-203a-3p/GAS2/p53信号通路调控肝癌细胞增殖过程。实验结果显示,Sox3能够通过mi R-203a-3p抑制GAS2和p53的蛋白水平表达,增殖实验结果也表明抑制mi R-203a-3p可以回复Sox3的促增殖效应,但是过表达GA S2又可以恢复Sox3对增殖的影响,这说明Sox3能够通过mi R-203a-3p/GAS2/p53信号通路调控肝癌细胞的生长过程。再次,本实验也阐述了Sox3促进肝癌细胞迁移和侵袭的具体的分子机制。通过q RT-PCR实验,我们发现Sox3可以在m RNA和蛋白水平促进AKT1的表达。大量研究表明,AKT/m TOR信号通路与癌症的发生有密切的联系,广泛参与结肠癌、乳腺癌、肺癌、宫颈癌等多种癌症的发生、发展和转移过程,所以我们探究了Sox3是否可以通过AKT/m TOR信号通路调控肝癌细胞的迁移和侵袭能力。我们通过使用针对AKT1的si RNA和小分子抑制剂抑制Hep G2细胞中AKT1的内源性表达,实验结果表明过表达Sox3同时沉默内源性AKT1的表达可以回复Sox3的促迁移和促侵袭效应,Sox3通过AKT1/m TOR信号通路调控EMT过程中的标志物E-cadherin和MMP9的表达;同时我们使用m TOR抑制剂也观察到一致的现象;这都表明,Sox3可以通过AKT/m TOR信号通路调控肝癌细胞的迁移和侵袭能力。最后,我们又进行了体内实验,通过裸鼠移植瘤实验、小动物活体成像系统、HE染色和免疫组化实验证明了Sox3在小鼠体内促进了肝癌细胞的成瘤能力和转移能力。综上所述,我们探究并发现了HBV促进肝癌发生和发展的两个新的致病机理。我们首先证明了HBV通过mi R-340-5p-ATF7-HSPA1B轴促进肝癌细胞的增殖和抑制其凋亡过程;其次,我们鉴定了Sox3作为肝癌发生中一个新的致癌基因,通过mi R-203a-3p/GAS2/p53信号通路调控肝癌细胞的生长过程,通过AKT/m TO R信号通路调控肝癌细胞的迁移和侵袭能力。我们的研究为阐明HBV在肝癌中的功能提供了新的实验证据,为肝癌发生、发展和转移提供了新的分子机理,为肝癌的早期诊断和治疗提供了新的标志物和靶标。