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研究目的:研究在肺腺癌侵袭转移过程中CAMKⅡ所发挥的作用,初步探讨其与EGFR通路激活之间的关系,初步明确其转录调控的机制,为EGFR耐药的肺腺癌患者提供新的诊断、预后及治疗靶点,为EGFR突变型肺腺癌患者发生耐药进展提供进一步的理论基础。研究内容:(1)探究CAMKⅡ表达与肺腺癌侵袭转移之间的关系,分析CAMKⅡ的临床病理学意义及预后价值。(2)探究CAMKⅡ与EGFR通路之间的关系。(3)分析转录因子CREB对CAMKⅡ的转录调控作用。研究方法:(1)收集2011年6月到12月天津医科大学肿瘤医院临床预后资料完整的肺腺癌患者石蜡组织标本160例,通过免疫组织化学染色分析不同组织学亚型的肺腺癌组织中CAMKⅡ表达水平之间的差异,分析CAMKⅡ与年龄、性别、吸烟史等临床信息之间的相互关系,分析CAMKⅡ表达情况与基因突变之间的相互关系,分析CAMKⅡ与淋巴结转移及远处转移之间的相互关系,分析CAMKⅡ表达情况与患者生存之间的关系;收集21例淋巴结转移肺腺癌患者石蜡组织标本,通过免疫组织化学染色比较原发灶与转移灶CAMKⅡ表达情况。采用Transwell和伤口愈合实验的方法分析肺腺癌细胞系H1299和Calu3在CAMKⅡ高表达前后对肺腺癌侵袭能力的影响。(2)收集8例EGFR耐药患者耐药前后石蜡组织标本,使用免疫组织化学染色分析比较其耐药前后CAMKⅡ表达情况;肺腺癌细胞系H1299和Calu3用表皮生长因子(EGF)诱导EGFR通路被激活,采用Wesetern Blot的试验方法分别检测15’,30’,45’,60’时p-CAMKⅡ、CAMKⅡ、p-EGFR、EGFR蛋白的表达情况,探究EGFR-CAMKⅡ通路的激活及其调控机制;肺腺癌细胞系H1299和Calu3用不同浓度梯度、不同时间梯度EGFR小分子抑制剂AG1478预培养后使用EGF刺激,采用Wesetern Blot的试验方法检测p-CAMKⅡ、CAMKⅡ、p-EGFR、EGFR蛋白的表达情况,探究EGFR-CAMKⅡ通路的激活及抑制的调控机制;(3)生物信息学预测CAMKⅡ启动子区转录因子;应用Pearson法分析肺腺癌患者组织中CREB与CAMKⅡ表达相关性。肺腺癌细胞系H1299和Calu3用表皮生长因子(EGF)刺激,采用Wesetern Blot的试验方法检测不同时间点CREB和CAMKⅡ的表达情况;采用分别转染CREB高表达质粒以及空白质粒的方法,将按常规方法进行培养的肺腺癌细胞系H1299和Calu3分为实验组(CREB高表达组)和对照组,使用Western Blot的方法分析CREB高表达后CAMKⅡ表达情况的变化;将转染CREB过表达质粒的肺腺癌细胞系H1299和Calu3用不同浓度梯度、不同时间梯度CREB抑制剂SGC抑制,使用Westernblot分析CREB降表达后CAMKⅡ表达情况。研究结果:(1)CAMKⅡ高表达与肺腺癌组织学亚型病理分型具有相关性(p<0.05),低分化(微乳头为主型、实性为主型)肺腺癌中CAMKⅡ表达明显高于高分化(伏壁为主型、腺泡为主型)肺腺癌。CAMKⅡ表达与淋巴结转移、远处转移及TNM分期相关(p<0.05)。CAMKⅡ高表达易发生转移。CAMKⅡ与生存相关(p<0.05),CAMKⅡ高表达患者生存期明显低于CAMKⅡ低表达患者。CAMKⅡ与EGFR突变相关(p<0.05)。肺腺癌淋巴结转移灶CAMKⅡ表达明显高于原发灶(p<0.05)。划痕实验表明CAMKⅡ高表达后伤口愈合明显增多,transwell侵袭实验穿膜细胞数目明显增多(p<0.05)。(2)EGFR耐药患者组织中CAMKⅡ表达明显高于使用靶向药物前。经EGF刺激后,1小时内肺腺癌细胞系H1299和Calu3 EGFR-CAMKⅡ通路被激活,p-EGFR和p-CAMKⅡ先上升后下降,30分钟时p-EGFR和p-CAMKⅡ蛋白表达最多,EGFR和CAMKⅡ表达不变。AG1478预处理后给予EGF刺激,p-EGFR和p-CAMKⅡ表达先下降后保持不变,0.75μΜAG1478为最适浓度,3小时为AG1478最适抑制时间。(3)肺腺癌患者中CREB表达与CAMKⅡ表达情况呈正相关。使用EGF刺激肺腺癌细胞H1299和Calu3,48小时伴随CREB上升,p-CAMKⅡ和CAMKⅡ总体表达上升。使用CREB抑制剂SGC作用于肺腺癌细胞系H1299和Calu3,24小时CAMKⅡ表达下降。使用CREB质粒转染肺腺癌细胞H1299和Calu3,CAMKⅡ表达上升。研究结论:(1)CAMKⅡ的高表达与肺腺癌侵袭转移过程密切相关;(2)CAMKⅡ的高表达与EGFR通路激活相关;(3)CREB参与调控CAMKⅡ的转录调控。