论文部分内容阅读
顺式-4-L-羟脯氨酸(cis-4-Hydroxy proline,cis-4-Hyp)不属于20种常见的氨基酸,是L-脯氨酸被顺式-4-L-羟化酶羟基化修饰后的产物。顺式-4-L-羟脯氨酸是合成宜他霉素和微鞘藻素两种肽类抗生素的原料,并且临床上被认为可做为抗癌药物,因此cis-4-Hyp的生产和应用一直受到业界的广泛关注。目前,国外生产羟脯氨酸的有效生产方法是生物转化法,即利用脯氨酸羟化酶在Fe2+、α-酮戊二酸存在的介质中将底物L-脯氨酸转化为L-羟脯氨酸。本研究首先通过调整大肠杆菌的密码子偏好性以及mRNA二级结构对顺式-4-L-脯氨酸(cis-4-proline hydroxylase,cis-P4H)进行优化,将优化后的基因连接到载体pET-M-3C上,获得重组质粒pET-cis-P4H。然后将重组质粒转化到大肠杆菌后获得重组大肠杆菌BL21(pET-cis-P4H)。采用Ni-NTA亲和层析柱分离纯化cis-P4H,测定cis-P4H的酶活和稳定性。然后采用生物转化法制备cis-4-Hyp,并通过单因素试验和正交试验对相关的转化条件进行优化。对重组大肠杆菌进行产cis-P4H的发酵条件进行优化,通过单因素试验和正交试验确定发酵培养基组分和发酵条件(诱导剂乳糖浓度、接种量、发酵培养基初始pH和发酵温度),然后进行5 L发酵罐放大培养。获得的主要研究结果如下:1、将来源于中华根瘤菌属的顺式-4-L-脯氨酸羟化酶基因进行密码子优化和全基因合成并构建到质粒pET-M-3C上,将重组质粒转化到大肠杆菌中BL21-CodonPlus(DE3)中,构建了一株产顺式-4-L-脯氨酸羟化酶的工程菌。2、对产顺式-4-L-脯氨酸羟化酶的工程菌进行诱导表达,并采用Ni-NTA亲和层析柱分离纯化cis-P4H,测定cis-P4H的酶活和稳定性,cis-P4H的酶活为2.65 U/mg,半衰期为2.32 h。3、采用生物转化法制备cis-4-Hyp,并对相关的转化条件进行了优化,优化后的结果为:采用OD600为0.9时加入IPTG至浓度0.2 mol/L,28°C下诱导5 h后获得的工程菌菌体构建转化体系,在转化体系pH为6.5,转化温度为31°C,转化时间为60 h时,L-脯氨酸转化率最高达到83.33%。4、对重组大肠杆菌进行摇瓶发酵研究,确定发酵培养基的配方为葡萄糖为20 g/L、酵母浸粉为5 g/L、硫酸铵为3 g/L、磷酸二氢钾1 g/L、氯化钠为1.5g/l、硫酸镁为0.1g/l、硫酸亚铁为0.1g/l。诱导剂乳糖浓度8g/l,发酵培养基初始ph为7.0,接种量为10%,发酵温度为30°c,然后进一步采用5l发酵罐进行放大培养,确定发酵时间为28h,最高酶活为4.89u/ml。将发酵所得的菌体作酶源转化生产顺式-4-l-脯氨酸,产量为6.23g/l。